杨相政 李喜宏 马宏原 申灵敏

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

饲料在生产、加工、运输储藏过程中会因为各种自然环境因素使饲料的原有养分降低和品质的劣化，严重者导致畜禽采食后中毒或死亡［1－2］。饲养的动物食用了细菌总数超标的饲料，一旦免疫力降低，就会引发疾病，给养殖场带来巨大经济损失。影响饲料品质最重要的因素是霉菌的破坏，据联合国粮农组织估计，全世界每年大约有5%～7%的粮食、饲料等农产品遭受霉菌的侵蚀，全世界每年由此造成的经济损失可达数千亿美元。我国每年因为在储藏过程受到霉菌污染而变质浪费的饲料占总产量的15%左右［3］。因此，饲料霉菌毒素感染已成为饲料工业和畜牧业生产中不可忽视的问题。

饲料的腐败变质主要是发生在储藏期间，霉变饲料中的霉菌毒素不仅降低了饲料的营养价值，还会诱发畜禽的急慢性中毒，严重时还可造成畜禽中毒死亡，其中影响最强、毒性最大的黄曲霉毒素B1能引起动物急性中毒死亡，有强烈的致癌作用［4－5］，还会影响奶、蛋、肉等畜产品的质量，直接危害人的健康。因此研究如何防止饲料的的腐败变质具有非常重要的现实意义。目前国内外对鸡饲料加工、运输、储藏期间防止霉菌腐败变质的研究主要集中在添加防腐剂、防腐包装和射线照射结合化学处理等［5］，其中运用最多是添加防腐剂防腐。但是防霉剂不能完全保证饲料不霉变，只能在一定条件下延长饲料霉变的时间［6］，而且作用的范围有限［7］。对于气调储藏饲料防霉变鲜有报道。

粮食气调储藏是国际上应用较为普遍和先进的粮食储藏方法之一，可以比较好的保持粮食品质，杀灭害虫，防止有害微生物的生长［8］。本试验采用高CO2气调储藏技术储藏鸡饲料，通过测定分析鸡饲料的细菌总数、霉菌总数和黄曲霉总数的变化，研究高CO2对鸡饲料霉变的调控效应，以期为CO2气调储藏鸡饲料的应用提供技术参考和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡饲料:天津市新星兽药厂，主要成分为玉米60%、豆粕13%和麸皮9%，含水量11%。

1.2 主要仪器和试剂

DK－98－1型数显恒温水浴锅:天津市泰斯特仪器有限公司;WH－3微型漩涡混合仪:上海沪西分析仪器有限公司;SHZ－82型恒温振荡器:常州国华电器有限公司;YXZ280B型高压灭菌锅:上海三申医疗器械有限公司;YS100型Nikon生物显微镜:上海泽仕光电科技有限公司;手持式O2/CO2分析仪:北京卓川电子科技有限公司;甲醇:天津市风船化学试剂科技有限公司;毒素检测试剂盒:上海必发生化科技有限公司

1.3 处理方法

称取每份1 kg鸡饲料装入布袋，再放入10 L气调瓶中，充入不同浓度的CO2和O2的混合气体。储藏的气体条件为:自然空气(CK)、2%～3%O2+30%CO2(TR1)、2%～3%O2+50%CO2(TR2)。在实验室低温粮食保鲜库内，调节TD－2型温度梯度箱工作温度分别为0、10、23和30℃，将各处理分别置于不同温度的梯度箱内，储藏时间4月，定期使用手持式O2/CO2分析仪定期检测气体变化，调整气体环境。每30 d取样测定1次指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 细菌总数

测定程序参照GB/T 13093—2006《饲料中细菌总数的测定》方法测定。所用培养基为营养琼脂培养基和水琼脂培养基。

1.4.2 霉菌总数

测定程序参照GB/T 13092—2006《饲料中霉菌总数的测定》方法进行测定。所用培养基为高盐察氏培养基。

1.4.3 黄曲霉总数

测定程序参照GB/T 4789.16—2003《常见产毒菌的鉴定》对菌落进行鉴定。

1.4.4 黄曲霉毒素B1含量的检测

利用Bcacon毒素检测试剂盒进行饲料中毒素含量的检测。已提供的试剂与材料有:真空包装且包含干燥剂的8 mm×12 mm的微孔板;5瓶质量浓度分别为 0、2.0、4.0、10、25 μg/kg 的霉菌毒素标准品;1瓶酶标记物;1瓶底物溶液;1瓶停止液。

1.4.4.1 提取液的制备

将80 mL甲醇和20 mL蒸馏水置于锥形瓶中，震荡摇匀。

1.4.4.2 样品制备

粉碎后的样品过20目筛，称取50 g样品和5.0 g氯化钠置于带塞锥形瓶中，并向其中加入100 mL甲醇/水(80∶20)提取液，摇匀，静置2～3 min使样品沉淀，然后用玻璃纤维滤纸过滤10 mL萃取液，取5 mL萃取液用20 mL蒸馏水稀释，过滤稀释液待测。

1.4.4.3 检测程序

先将毒素标准品溶液及样品液加入测试孔中，然后向测试孔中加入毒素的酶标记物，样品及酶标记物竞争结合连接在微孔上的抗体，10 min培养后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未结合的霉菌毒素和酶标记物，加入无色的底物溶液，培养10 min，所有结合的酶标记物使底物转化成蓝色物质。加入停止液，然后将测试孔放在酶标仪上读取吸光度值，未知浓度样品与标准吸光度值进行比较，就可以得到样品的黄曲霉毒素B1的浓度。

1.5 数据处理与分析

全部试验数据用Microsoft Excel 2007进行统计处理，采用SPSS10.0软件检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 细菌总数的检测

当温度一定时，在一定浓度范围内，随着二氧化碳浓度的升高，其抑菌效果越明显。但是超出一定浓度界限时，随着二氧化碳浓度升高，抑菌效果反而下降［8］。褚益可等［9］研究牛肉的气调保鲜结果表明:不是CO2浓度越高其抑菌效果越强，当CO2体积分数达到45%后，其抑菌能力反而随着CO2浓度的升高而下降。

不同的气体环境对饲料中细菌总数的影响较大(表1)。在0℃时，高浓度CO2对鸡饲料抑菌效果很明显。鸡饲料在30%CO2和50%CO2的条件下储藏90 d细菌总数都小于限量标准2×106cfu/g，前60 d细菌增长相对较慢;10℃时，30%CO2和50%CO2的条件下储藏60 d后，细菌总数不超标;30℃时，30%CO2和50%CO2的条件下储藏30 d内，细菌总数不超标。当温度一定时，CO2体积分数为0%～50%的范围内，随着二氧化碳浓度的升高，对细菌生长的抑制就越明显(图1)。

表1 细菌菌落总数均值

图1 鸡饲料不同浓度CO2处理同一稀释浓度下储藏60 d后细菌菌落图

2.2 霉菌总数的检测

气体对真菌的代谢活动有明显影响。高浓度二氧化碳气体环境下，霉菌孢子很难萌发，繁殖较慢［9］。

如表2和图2可知，当温度一定，高浓度的CO2对霉菌的生长有明显的抑制作用。0℃时，30%CO2下，霉菌生长极其缓慢，储藏120 d后，霉菌总数远小于对照组(CK)，低于国家限量标准4.5×103cfu/g;50%CO2时，霉菌几乎不生长，总数基本不变。10℃时，CO2体积分数为30%和50%条件下，饲料储藏120 d后，霉菌总数不超标，而对照组储藏60 d后，霉菌总数超过限量标准，饲料已经霉变。30℃时，高浓度的CO2对霉菌的抑制效果不是特别显著，CO2体积分数为30%和50%时，饲料储藏超过60 d霉菌均低于限量标准。对照组储藏30 d后，霉菌已经超标，饲料的营养成分已经受到霉菌的破坏。

表2 霉菌菌落总数均值

图2 鸡饲料不同浓度CO2处理同一稀释浓度下储藏60 d后霉菌菌落图

2.3 黄曲霉总数的检测

当二氧化碳体积分数达到60%以上时，能抑制小麦或玉米内的霉菌生长及青霉或黄曲霉毒素的产生［10－11］。由表3和图3可知，高浓度 CO2明显抑制鸡饲料内黄曲霉的生长，并且浓度越高，效果越明显。当温度为0℃和10℃时，50%CO2对黄曲霉生长抑制显著，黄曲霉生长缓慢;当温度为30℃时，抑菌效果不显著，这与霉菌总数增长趋势一致。可见，高浓度CO2对于常温和低温储藏下的鸡饲料内霉菌的生长抑制效果显著，而对于高温储藏下的鸡饲料内的霉菌生长抑制效果不显著。

表3 黄曲霉菌菌落总数均值

图3 饲料中黄曲霉菌落的不同形态

2.4 常温储存下黄曲霉毒素随时间的变化情况

高浓度CO2处理可有效抑制鸡饲料常温储藏过程中黄曲霉毒素B1含量的变化，而对照组黄曲霉毒素B1含量变化很大。由图4可知，储藏到90 d，30%CO2和50%CO2处理的鸡饲料黄曲霉毒素B1的含量分别为 19.3 μg/kg 和 12.6 μg/kg，均低于国家限量标准20μg/kg。储藏到120d，50%CO2处理的鸡饲料黄曲霉毒素B1的含量为17.4 μg/kg，仍低于国家标准，而对照组黄曲霉毒素B1的含量为56.2 μg/kg，远远超出国家标准，而且饲料已经发生严重霉变，颜色变黑，有恶臭，几乎失去使用价值。因此高浓度的能有效抑制饲料中霉菌特别是黄曲霉的生长，进而抑制黄曲霉毒素的产生。

图4 不同浓度CO2处理对黄曲霉毒素B1含量的影响

3 结论

3.1 当温度一定时，在一定浓度范围内，CO2浓度越高，对鸡饲料内细菌和霉菌的抑制效果越显。高浓度的CO2对于常温和低温储藏下的鸡饲料内霉菌的生长抑制效果显著，而对于高温储藏下的鸡饲料内的霉菌生长抑制效果不显著。

3.2 高浓度CO2对于室温下储藏的鸡饲料内黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1含量的变化有明显的影响，50%CO2处理能明显抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素B1的产生，进而防止饲料霉变变质。

3.3 10℃ +30%CO2和常温+50%CO2的储藏环境可有效抑制鸡饲料内细菌和霉菌的生长，用于鸡饲料防霉储藏。鸡饲料在此条件下储藏90 d细菌总数、霉菌总数以及黄曲霉毒素均低于国家限量标准。

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