仝建业，闫洪超

(1徐州医学院研究生院，江苏徐州221002;2徐州医学院附属医院)

WWOX基因是一种抑癌基因［1］。研究证实，WWOX基因突变或缺失与胰腺癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，通过改变WWOX基因的表达可以调节肿瘤生长［2～4］。Cyclin D1基因是细胞增殖调控的关键蛋白，是一种癌基因。在G1期，当Cyclin D1与细胞周期素依赖性激酶(CDK4)结合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使肿瘤抑制蛋白Rb发生磷酸化，促进肿瘤发生。我们将外源性WWOX基因转染到人卵巢癌干细胞中，研究其对Cyclin D1、CDK4蛋白的影响，探讨治疗卵巢癌的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌干细胞由本课题组筛选并保存［5］，pcDNA3.1-WWOX 真核表达载体由本课题组构建并保存［6］，pcDNA3.1空质粒由徐州医学院分子生物学研究中心胡书群老师惠赠，脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒、G418购自 Invitrogen公司，WWOX、Cyclin D1和CDK4一抗及二抗均由Chemicon公司提供，碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人卵巢癌干细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 基因转染 按 LipofectamineTM2000说明书将pcDNA3.1-WWOX及pcDNA3.1空质粒分别转染对数生长期的卵巢癌干细胞，以600μg/mL新霉素衍生物G418维持筛选，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。分别将成功转染pcDNA3.1-WWOX和pcDNA3.1质粒的干细胞组命名为 pcDNA3.1-WWOX重组质粒组、空质粒组，以未转染的卵巢癌干细胞作为未转染组。

1.3 检测指标

1.3.1 WWOX蛋白表达 采用Western blot法。常规提取pcDNA3.1-WWOX重组质粒组、空质粒组及对照组细胞总蛋白，参照BCA法说明书测定蛋白浓度。以10%凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶泳(SDSPAGE)、转膜、WWOX单克隆抗体结合，再用碱性磷酸酶结合的二抗结合，增强化学发光法(ECL)显色后照相，观察各组细胞WWOX蛋白表达情况。

1.3.2 细胞周期分布 采用流式细胞仪分析。将对数生长期的三组细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化，按3×105/孔细胞在6孔板上接种细胞，分别在细胞接种后48 h收集上述各组细胞，各约1×106个细胞，加入终浓度70%冷乙醇，4℃固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase A(1 mg/mL)于37℃水浴30 min，再加25 mg/mL的PI染色，4℃避光30 min，经尼龙网过滤后，流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况，计算各组G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占百分数。

1.3.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表达 采用Western blot法。常规提取pcDNA3.1-WWOX重组质粒组、空质粒组及对照组细胞总蛋白，参照BCA法说明书测定蛋白浓度。以10%凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶泳(SDS-PAGE)、转膜、Cyclin D1及CDK4单克隆抗体结合，再用碱性磷酸酶结合的二抗结合，增强化学发光法(ECL)显色后照相，观察各组细胞Cyclin D1及CDK4蛋白表达情况。

2 结果

2.1 WWOX蛋白表达 重组质粒组WWOX蛋白呈高表达，而空质粒组及未转染组未检测到WWOX蛋白的表达，见图1。

图1 各组细胞WWOX蛋白的表达

2.2 细胞周期分布 未转染组、空质粒组、重组质粒组G0/G1期细胞所占百分数分别为33.69% ±1.28%、33.87% ± 0.84%、64.47% ± 0.60%，重组质粒组G0/G1期细胞百分比高于空质粒组及未转染组(P＜0.01)。未转染组、空质粒组、重组质粒组S期细胞所占百分数分别为 58.47% ±0.71%、58.03% ±0.72%、27.52% ±0.60%，重组质粒组 S期细胞所占百分数低于空质粒组及未转染组(P＜0.01)。未转染组、空质粒组、重组质粒组G2/M期细胞所占百分数分别为7.67% ±0.58%、8.0% ±0.00%、8.00% ±0.00%，重组质粒组 G2/M 期细胞所占比例低于空质粒组及未转染组(P＜0.01)。

2.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表达 未转染组、空质粒组、重组质粒组Cyclin D1蛋白表达水平分别为1.601 ±0.028、1.607 ±0.045、1.068 ±0.057，重组质粒组Cyclin D1蛋白表达水平高于其他两组(P＜0.05)。未转染组、空质粒组、重组质粒组CDK4蛋白表达水平分别为 2.795 ±0.012、2.744 ±0.031、1.296±0.016，重组质粒组 CDK4蛋白表达水平高于其他两组(P ＜0.05)。

3 讨论

WWOX基因约1 Mb大小，cDNA全长2 264个碱基。WWOX基因在多种恶性肿瘤组织中表达异常，可能是一个广谱的抑癌基因。研究表明WWOX基因在恶性肿瘤尤其是性激素依赖性肿瘤的发生发展中起着重要作用［7～9］。Gourley 等［10］研究发现卵巢癌组织中 WWOX mRNA的表达降低，提示WWOX基因能够抑制卵巢肿瘤的发生。

Cyclin D1基因由295个氨基酸组成，分子量为34 kD，是细胞增殖调控的关键蛋白，与肿瘤发生密切相关，被认为是一种癌基因。在G1期，当Cyclin D1与CDK4结合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使肿瘤抑制蛋白Rb发生磷酸化。高磷酸化的Rb蛋白因构象改变而与转录因子E2F分离，E2F被释放而发挥其转录因子的效应，促进与DNA合成有关的基因转录，促使细胞由G1期进入S期，从而促进细胞周期。Brown等［11］认为Cyclin D1表达可作为细胞增殖的标志，且表达量增加与卵巢癌的恶性行为与复发有关。

2000年，Weissman等［12］在干细胞的理论的基础上首次提出"肿瘤干细胞学说"。该学说认为肿瘤是一种干细胞疾病，肿瘤干细胞是一类能够导致肿瘤发生的具有自我更新能力的细胞，能够进行无限增殖和多向分化，被认为是肿瘤发生、异常增殖、侵袭、转移、耐药以及复发的根源［13］。Bapat等［14］通过对卵巢癌患者腹水中肿瘤细胞的研究发现了一些能悬浮生长的球体细胞，这些球体细胞在体外培养中具有极强的克隆能力，能够自我更新，并且将这些球体细胞接种于裸鼠后能够在裸鼠体内自我更新并分化成相同性质的肿瘤。证实卵巢癌中有卵巢肿瘤干细胞的存在，是卵巢癌治疗的一个潜在的靶点。为进一步深入研究卵巢癌的发生、发展过程，本课题组以人HO8910细胞(人卵巢低分化浆液性囊腺癌细胞株)为基础，采用紫杉醇结合无血清培养基悬浮培养法，并通过体内及体外实验成功的筛选出具有阳性表达特征的卵巢癌干细胞，并对其特异性标记物及生物学特性进行了鉴定［5］，为我们下一步的研究打下了坚实的基础。

本研究以pcDNA3.1-WWOX为表达载体，采用细胞转染技术，获得稳定高表达WWOX基因的卵巢癌干细胞重组质粒组，发现重组质粒组的Cyclin D1和CDK4表达明显降低，提示WWOX基因参与了Cyclin D1、CDK4的代谢，且重组质粒组细胞被显著抑制在G0/G1期，其机制可能与WWOX基因下调Cyclin D1、CDK4的表达有关。

综上所述，WWOX基因是与人卵巢癌发生和发展密切相关的一种抑癌基因，将其导入到人卵巢癌干细胞系中可明显抑制卵巢癌干细胞的生长增殖，为卵巢癌的基因治疗提供了依据。

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