孙晓华，赖克强，黄轶群，王 婧，*，吴 轶，肖竹青

(1.上海海洋大学食品学院，上海201306;2.上海市食品研究所，上海200235)

晚期糖基化终末产物(AGEs)是美拉德反应产生的一类复杂的化合物，主要由脂质氧化途径和还原糖(及其氧化产物)与蛋白质的游离氨基通过非酶褐变途径产生［1］。食品热加工的过程中容易产生AGEs，有研究者发现，大约10%的食源性AGEs可以被吸收进入体内循环，并随着年龄的增长在体内累积［2］。人体内AGEs的积累与人类许多疾病都有着密不可分的关系，包括糖尿病、肾病、阿茨海默尔病、衰老和动脉粥样硬化等［3－4］。因此，控制 AGEs含量高的食品的摄入对于人类预防这类疾病尤其重要。AGEs主要包括:羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)、戊糖素(Pento－s)、吡咯啉(Pyr)等。其中，CML最先在食品中被检出，在实验室研究中通常被作为食品中AGEs产生的标志性物质［5］。

大多数AGEs可以自发荧光，许良元等人［6］主要研究了利用荧光光谱技术检测人体中的AGEs。但CML不能自发荧光，传统的用于 CML检测的方法——酶联免疫法(ELISA)［7－8］、高效液相色谱荧光检测法(HPLC－ FLD)［5，9］、气相色谱－ 质谱联用法(GC－MS)［10］都存在不同程度的缺陷。由于食品体系比较复杂，ELISA法特异性抗体选择比较困难，定量分析结果不可靠;HPLC－FLD和GC－MS法都需要将样品衍生化，样品处理复杂，衍生产物不稳定。而高效液相色谱－质谱联用法(HPLC－MS/MS)可以避免复杂的样品衍生化处理，能够进行准确定量。目前已经报道的 HPLC－MS/MS检测 CML 的方法［11－14］存在很大缺陷和不足，多数使用C18色谱柱进行分离，C18固相萃取小柱进行净化。而CML极性极强，如要达到在C18柱上保留必须使用离子对试剂。而离子对试剂会降低色谱柱寿命并污染质谱的离子源。本方法首次研究用HILIC亲水作用色谱柱进行分离，MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱对提取液萃取净化，在CML的提取和检测过程中都无需使用离子对试剂即可得到适当保留，同时避免了HPLC－FLD和GC－MS法复杂的样品衍生化处理过程，分析时间短，简便快速。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

37%盐酸、氢氧化钠、硼氢化钠、甲酸、乙酸铵、三氯甲烷、95%乙醇、硼酸、硼酸钠、甲基红、溴甲酚绿、硫酸铜、硫酸钾、氨水、浓硫酸 分析纯，国药集团;甲醇 HPLC级，美国 Sigma公司;CML标准品(纯度98%，CAS号 5746－04－3)、D4－CML 标准品(纯度98%)加拿大TRC公司。实验室用水为Milli－Q超纯水。CML和D4－CML标准品分别溶解在80%甲醇水溶液中，配成100mg/L溶液，储存在－20℃冰箱里备用，可保存6个月。

2695 Quattro Micro型液相色谱质谱联用仪(配套MassLynxV 4.1型数据采集及处理软件)、Atlantis HILIC亲水作用色谱柱(150mm ×2.1mm，3μm)、SunFire C18液相色谱柱(150mm × 2.1mm，5μm)、OASIS MCX混合型阳离子交换固相萃取小柱(60mg/3mL)美国Waters公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海精宏真空设备有限公司;TDL－5－A型离心机 上海安亭科学仪器厂;UDK159全自动凯氏定氮仪 意大利VELP公司;Milli－Q超纯水仪 美国Millipore公司;Supelclean LC－18固相萃取小柱(500mg/3mL)、Supelclean Alumina A酸性氧化铝小柱(100mg/3mL)美国Supelco公司;CNW SCX阳离子交换固相萃取小柱(500mg/3mL)上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC条件 Atlantis HILIC亲水作用色谱柱(150mm ×2.1mm，3μm);进样量 10μL;流动相速率0.2mL/min;柱温35℃;流动相A为甲醇(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸铵)，B为水(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸铵)。进行梯度洗脱，洗脱参数如表1所示。

表1 梯度洗脱参数Table 1 Parameters for procedure of gradient elution

1.2.2 MS/MS条件 电喷雾离子源(ESI);正离子扫描模式，驻留时间500ms;多反应监测模式(MRM);离子源温度120℃，脱溶剂温度350℃;进样锥电压20V，毛细管电压3.00kV;脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气流速50L/h，碰撞气体为氩气。

1.2.3 样品处理 从上海市15个不同的油条加工点(包括市场上普通的早餐摊点A和四种品牌的连锁餐饮店B、C、D、E各3个加工点)采集油条样品，样品经真空干燥后粉碎混匀。参考 Niquet－Léridon等［12］的研究进行样品前处理。称取0.5g粉末状样品，加入2mL硼酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH 9.2)和0.4mL硼氢化钠溶液(2mol/L，含0.1mol/L氢氧化钠)，混匀后在－4℃冰箱中放置8h进行还原反应。根据 Folch 法［15］，加入4mL 三氯甲烷－甲醇(2∶1，v∶v)溶液除去油条样品中的油脂，同时使蛋白质沉淀。5000r/min离心10min后，在沉淀物中加入4mL盐酸溶液(6mol/L)，在110℃条件下酸解24h。酸解液经真空干燥，用4mL超纯水再溶解后，取1mL再溶解溶液用水定容至50mL(添加内标物D4－CML，使其在最终样品溶液中浓度为100μg/L)。用3mL甲醇和3mL水分别洗净和活化MCX小柱，取2mL上述添加D4－CML的样品溶液过柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗净杂质后，用5mL含5%氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液经氮吹浓缩后，重新溶解在2mL甲醇－水(80∶20，v∶v)溶液中，得到最终样品溶液，取适量此溶液过0.22μm有机相滤膜后，用于HPLC－MS/MS分析。

根据 GB 5009.5－2010 食品中蛋白质的测定［16］，采用凯氏定氮法对油条中的蛋白质进行定量。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取净化小柱的选择

比较了C18SPE小柱、酸性氧化铝小柱、SCX和MCX阳离子交换柱四种固相萃取小柱对加标提取液的保留和净化效果。C18小柱不能将CML完全保留住，在上样流出液(应弃去部分)中检测出CML和D4－CML;酸性氧化铝小柱净化后，CML被保留在小柱内不能流出;而经SCX和MCX阳离子交换柱净化后，两者的回收率都接近100%，但MCX阳离子交换小柱对提取液的净化效果较SCX阳离子交换小柱好。因此，本方法采用MCX阳离子交换柱净化。

2.2 液相色谱柱的选择

比较了C18色谱柱和HILIC色谱柱对CML的保留效果。在不使用离子对试剂的前提条件下，用5%甲醇(含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)－95%水(含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)作为流动相，使用C18色谱柱进样(100μg/L CML标准溶液)分析;用80%甲醇(含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)－20%水(含2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)作为流动相，使用HILIC色谱柱进样(100μg/L CML标准溶液)分析;结果如图2、3所示，在C18柱中，CML的保留时间仅为1.21min，而在HILIC柱中的保留时间为3.47min。因此选用HILIC色谱柱可以不使用离子对试剂，能达到有效的保留CML，使其与杂质完全分离。

图1 使用C18色谱柱时CML(100μg/L)的总离子流色谱图Fig.1 Total ion spectrum of CML using C18column

图2 使用HILIC柱时CML(100μg/L)的总离子流色谱图Fig.2 Total ion spectrum of CML using HILIC column

2.3 流动相的选择

选择CML标准溶液(100μg/L)进样，通过实验比较了流动相甲醇－水和流动相乙腈－水对CML的洗脱效果，结果表明甲醇作为有机相时，CML的峰形更尖锐，因此流动相选择了甲醇和水。没有添加乙酸铵和甲酸时，CML不出峰或者色谱峰拖尾严重，可能是由于标准溶液和样品溶液pH的差异较大所致。在甲醇和水相中分别添加了2mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸，提高了离子化效率，改善了峰形，提高了灵敏度，从而降低了检测限。实验还讨论了不同的流动相比例对CML保留时间和峰形的影响，分别选取了90%、80%、50%三个甲醇浓度作为流动相。结果在确保色谱柱对CML的保留效果的同时，80%甲醇浓度得到的CML峰形最优，响应最强。在此基础上，为了增强CML与杂质的分离效果，经过实验优化采取了梯度洗脱程序(见表1)。

2.4 质谱条件的优化

对CML进行二级质谱扫描，CML母离子m/z 205.4主要被打碎成m/z 130.2，m/z 83.8两类离子碎片，这与文献报道一致［11－14］。本方法采用 m/z 130.2为定量离子，CML的二级质谱图见图3。

图3 CML的二级质谱图Fig.3 MS/MS fragments of CML

对锥孔电压、碰撞能量、驻留时间进行了优化，CML和D4－CML优化后的质谱条件见表2。

表2 MRM模式下CML和D4－CML的质谱参数Table 2 Mass parameters in multiple reaction monitoring(MRM)mode for CML and D4－CML

2.5 方法学验证

2.5.1 仪器检出限 配制成CML浓度分别为0、1、10、50、100μg/L的标准溶液(其中内标 D4－CML 浓度均为10μg/L)。经HPLC－MS/MS检测，得到CML和D4－CML混合标准溶液的MRM色谱图(图4)，D4－CML和CML的保留时间均为3.47min。分别以S/N=3和S/N=10的计算方法得出仪器检出限(LOD)为1μg/L，定量限(LOQ)为 3μg/L，表明本方法具有较高的灵敏度。

2.5.2 添加回收率和精密度 向油条酸解液中添加CML和D4－CML标准溶液，使加标量分别为10、20、100μg/kg。每个添加浓度平行测定6次(n=6)。见表3，添加回收率为89.5%～99.1%，相对标准偏差为2.1%～2.6%，回收率和精密度较高。由于油条中CML含量较高，将样品稀释了200倍后(与添加CML浓度相当)进行添加回收实验，样品基质也得到了稀释，因而基质效应小，定量准确度高。

2.6 油条中CML含量的测定

采集市场上15个不同加工点(包括市场上普通的早餐摊点A和四种品牌的连锁餐饮店B、C、D、E)的油条经样品处理后，用已建立的HPLC－MS/MS法进行CML含量测定。每个样品平行测定三次(n=3)，测得15种不同油条样品中的蛋白质和CML含量见表4。油条中CML含量范围为5.3±0.5～15.4±0.3mg/(kg样品)，也可以用油条中蛋白质含量来表示为69.3±8.2～182.2±3.1mg/(kg蛋白质)。

图4 CML和D4－CML混合标准溶液的MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram of CML and D4－CML mixed standard solution

由表中数据可以看出，不同来源的油条样品中CML含量有所差异;市场上普通早餐摊点的油条中CML含量稍高于四个不同品牌连锁店的油条;四个不同品牌连锁店之间的油条中CML含量有较大差异。蛋白质含量高的样品中CML含量相对较高，不同的油条加工点对油炸温度和油炸时间的控制上的差异也会导致美拉德反应程度的不同，因而使晚期糖基化终末产物中CML的产生量有所不同。

表3 油条中CML的添加回收实验结果(n=6)Table 3 Recovery rate of CML in fried bread sticks(n=6)

3 结论

本研究对食品中CML的提取方法进行了优化，样品处理无需衍生化;利用MCX固相萃取小柱净化和HILIC色谱柱对强极性的CML进行分离，无需使用离子对试剂即可得到有效保留;建立的HPLCMS/MS CML检测法成功地应用于具有中国特色的油炸食品(油条)的检测中。本方法操作简便、快速、准确度高、灵敏度好，为进一步研究不同种类食品中CML含量的检测、研究食品加工过程中影响CML的产生因素以及研究CML与人类疾病(糖尿病、尿毒症、动脉粥样硬化等)的关系奠定基础，进而为指导人们改进食品加工工艺提供依据。

表4 15种不同来源油条样品中CML含量和蛋白质含量(n=3)Table 4 CML content and protein content in 15 different source fried bread sticks(n=3)

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