李小艳，刘书亮，黄道梅，蒲 彪

(四川农业大学食品学院，四川雅安 625014)

乳酸菌作为一类可发酵糖产酸，对营养要求苛刻的中温型细菌，一般在低于15℃的条件下很难生长［1－2］。目前为止较多研究的是常温下分离的乳酸菌，所以泡菜工业化生产使用的菌剂也多为中温型乳酸菌制备的［3－5］，然而四川泡菜生产上蔬菜的收获和盐渍发酵也多集中在冬季，气温偏低，常温乳酸菌对泡菜的发酵速度过慢或停止，因而酸度低，杂菌抑制能力弱，为保证腌渍蔬菜不变质，必须增加食盐用量，导致在成品泡菜生产中增加脱盐工艺和废水处理成本，甚至还需要添加有机酸以符合泡菜酸度的要求，不但影响了泡菜品质还制约着泡菜的工业化生产，耐低温乳酸菌的应用可以解决这一生产问题。

乳酸菌培养过程中会受到许多因素的影响，其中乳酸菌的加富培养需要良好的增殖培养基［2，6］。实验室培养乳酸菌常用的MRS培养基不仅成分复杂、成本高、制作繁琐，而且接种乳酸菌培养后的发酵液黏度以及蛋白沉淀又不利于菌体的分离收集，而泡菜乳酸菌的培养可采用廉价易得的白菜汁、胡萝卜汁等。由于不同乳酸菌生长条件存在一定差异，因此筛选出不同种类乳酸菌的最适增殖培养基具有重要意义［7－8］。迄今为止，对于低温乳酸菌的研究报道较少，杨晓辉等［7］研究了30℃条件下，分离自泡菜的4株低温发酵乳酸菌Lat.1、Lat.2、Leu.1和leu.2在不同蔬菜汁培养基中的增殖情况;田菊梅等［8］研究了2株低温乳酸菌CGMCC4775和CGMCC4776在20～30℃条件下，混菌培养的增殖情况，然而对于低温(10℃)条件下，低温乳酸菌加富培养的研究尚未见报道。

本文以两株源于四川泡菜的优良耐低温泡菜乳酸菌 3m－1(Lactobacillus plantarum)和 8m－9(Leuconostoc mesenteroides)为对象，10℃条件下，通过在白菜汁培养基中添加碳源、氮源及缓冲剂优化了其最适的增殖培养基配方。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌3m－1(Lactobacillus plantarum)，肠膜明串珠菌8m－9(Leuconostoc mesenteroides)分离于四川泡菜样品，现由四川农业大学食品微生物实验室保藏。

培养基:MRS培养基;白菜汁基础培养基按文献［9］制备。

主要药品:蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、琼脂粉等 均为生化试剂(BR);柠檬酸二胺、葡萄糖、乳糖、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、磷酸氢二铵、吐温80、碳酸钙等 均为分析纯(AR)。

主要仪器:DHP－9162型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;手提式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司;pH计 PB－10;DHG－9245A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;SW－CJ－1F洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 10℃条件下两株低温乳酸菌生长曲线的测定将活化菌株接种于白菜汁基础培养基中，10℃培养192h，每12h取样，测定发酵液活菌数、OD600/10和pH，确定培养菌株的收获期。

1.2.2 两株低温乳酸菌增殖因子的筛选 在白菜汁基础培养基中，分别添加1%蛋白胨、1%大豆蛋白胨、1%胰蛋白胨、1%牛肉膏、0.5%酵母膏、1%乳糖、2%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾、0.5%CaCO3，制成各种不同增殖培养基，将活化菌株接种于上述培养基中，10℃培养72h，测定发酵液培养前后活菌数和pH。

1.2.3 两株低温乳酸菌增殖的最适培养基配方的优化 向白菜汁基础培养基中添加对菌株生长影响较大的营养因子，按正交实验因素水平表1(考虑单因素水平对菌株生长影响同时参考文献［9］)配制培养基。将活化菌株接种于上述培养基中，10℃培养72h，测定发酵液培养前后活菌数和pH。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factor level of orthogonal experiment

1.2.4 两株低温乳酸菌增殖的最适培养基配方的验证实验 将活化菌株接种于白菜汁基础培养基、MRS培养基以及优化的最适培养基中，10℃培养72h，测定发酵液培养前后活菌数和pH。

1.2.5 几个指标的测定方法 活菌数:采用平板菌落计数法;

OD600/10:采用无菌生理盐水将培养液稀释10倍，在600nm下测定其吸光度值;

pH:采用精密pH计直接测定。

2 结果与分析

2.1 10℃条件下两株耐低温乳酸菌的生长曲线

10℃条件下，菌株3m－1和8m－9在白菜汁基础培养基中的生长曲线分别如图1和图2所示。由图1和图2可知，10℃条件下，菌株3m－1和8m－9在白菜汁基础培养基中培养12h后细胞生物量开始快速增加，同时发酵液pH显著降低，72h后细胞生物量和发酵液pH都趋于稳定，活菌数达到最大值，分别为1.12×109cfu/mL和 8.5×108cfu/mL，菌株3m－1在培养132h后活菌数开始下降，而菌株8m－9在培养84h后活菌数开始下降，从整个发酵过程可确定菌株的最佳收获期为72h。

图1 10℃条件下菌株3m－1在白菜汁基础培养基中的生长曲线Fig.1 The growth curve of strain 3m－1 in cabbage basal medium at 10℃

图2 10℃条件下菌株8m－9在白菜汁基础培养基中的生长曲线Fig.2 The growth curve of strain 8m－9 in cabbage basal medium at 10℃

2.2 两株低温乳酸菌增殖因子的筛选结果

10℃条件下，白菜汁基础培养基中添加不同营养因子，菌株3m－1和8m－9的生长情况见表2。乳酸菌为化能异养菌，营养要求苛刻［10］，MRS培养基虽可满足乳酸菌的营养需求，但其成分复杂，成本较高，发酵液的黏度及蛋白沉淀又会影响菌体的分离收集，所以也有采用廉价易得的蔬菜汁培养基［11－12］。本实验以白菜汁为基础培养基，通过添加不同的增殖因子，以期获得高活菌数，而且白菜汁的驯化环境可以使菌种更好的适应泡菜发酵;乳酸菌发酵过程中会产生乳酸降低发酵液pH而抑制其生长，所以可通过添加磷酸缓冲液或钙盐消除抑制［15］。由表2可知，10℃条件下，添加的不同增殖因子对菌株3m－1和8m－9均有不同的增殖效果(p＜0.05)，但活菌数都低于MRS培养基(p＜0.05)，其中以蛋白胨、牛肉膏、乳糖和葡萄糖为最佳增殖因子，为乳酸菌提供丰富的氮源和碳源;添加的缓冲剂—磷酸氢二钾和碳酸钙都具有一定的增殖效果(p＜0.05)，但碳酸钙会沉积底部，不利于收集菌体，因此选用磷酸二氢钾作为缓冲剂。

表2 在白菜汁基础培养基中添加不同营养因子对菌株3m－1和8m－9生长的影响Table 2 Effects of adding different nutritional factors into cabbage basal medium on the growth of strain 3m－1 and 8m－9

表3 优化菌株3m－1增殖培养基的四因素三水平(L34)正交实验表Table 3 Design of enrichment media optimization orthogonal experiment of strain 3m－1

2.3 两株低温乳酸菌增殖培养基的最适培养基配方

10℃条件下，两株耐低温乳酸菌(菌株3m－1和8m－9)在白菜汁基础培养基中添加不同增殖因子正交实验结果分别见表3和表4。不同乳酸菌的生长条件存在一定的差异。由表3可知，增殖因子对菌株3m－1生长的影响顺序为:蛋白胨＞葡萄糖＞牛肉膏＞乳糖，其增殖的改良白菜汁培养基配方为:白菜汁基础培养基中添加1.0%蛋白胨、0.5%牛肉膏、1.0%乳糖、1.5%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾，10℃条件下培养72h，活菌数达到6.05×109cfu/mL，明显高于其它培养基(p＜0.05);由表4可知，增殖因子对菌株8m－9生长的影响顺序为:蛋白胨＞牛肉膏＞葡萄糖＞乳糖，其增殖的改良白菜汁培养基为:白菜汁基础培养基中添加1.5%蛋白胨、1.0%牛肉膏、0.5%乳糖、1.5%葡萄糖、0.2%磷酸氢二钾，10℃条件下培养72h，活菌数达到7.45×109cfu/mL，明显高于其它培养基(p＜0.05)。乳酸菌对蛋白分解能力较弱，培养基中氨基酸的含量直接影响其增殖的速度，其中水解的蛋白类物质如蛋白胨和牛肉膏可以为其提供丰富的氮源，同时乳酸菌利用糖产酸，其中葡萄糖和乳糖为其提供丰富的碳源促进其生长。

表4 优化菌株8m－9增殖培养基的四因素三水平(L34)正交实验表Table 4 Design of enrichment media optimization orthogonal experiment of strain 8m－9

表5 不同培养基对菌株3m－1和8m－9生长的影响Table 5 Effects of growth in strain 3m－1 and 8m－9 after incubation at different media

2.1.4 最优培养基验证实验结果 10℃条件下，不同培养基对菌株3m－1和8m－9生长的影响结果见表5。由表5可知，菌株3m－1和8m－9在改良白菜汁培养基中培养72h后活菌数分别达到6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，与白菜汁基础培养基相比，提高了6.1倍和10.4倍且差异性显著(p＜0.05)，而与采用MRS培养基培养的活菌数相近无显著性差异(p＞0.05)。

3 讨论与结论

泡菜作为我国传统的乳酸菌发酵食品，其中蕴含丰富的乳酸菌资源［1］，而乳酸菌作为一类化能异养菌，蛋白质分解和氨基酸合成能力较弱，只能通过糖类发酵获取能量，对培养基的营养要求比较苛刻，所以需向其生长的环境提供适量的营养物质［10，13－14］。

迄今为止，关于乳酸菌增殖培养基的报道也多为常温条件下的研究［15－16］，本文以两株源于四川泡菜的耐低温乳酸菌3m－1(Lactobacillus plantarum)和8m－9(Leuconostoc mesenteroides)为对象，选用廉价的富含碳水化合物、维生素、无机盐及植物蛋白，能满足乳酸菌的基本生长的白菜汁为基础培养基，同时为提高其增殖效果，向白菜汁培养基中添加了增殖因子碳源、氮源及缓冲剂，最终确定了其增殖培养基分别为:白菜汁基础培养基中添加蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，乳糖1.0%，葡萄糖1.5%，磷酸氢二钾0.2%;白菜汁基础培养基中添加蛋白胨1.5%，牛肉膏1.0%，乳糖 0.5%，葡萄糖 1.5%，磷酸氢二钾0.2%，优于吴蕊［9］等在低温条件分离了肠膜明串珠菌LN、植物乳杆菌JL和短乳杆菌LS，而在30℃条件下优化了短乳杆菌LS的白菜汁增殖培养基，且同时确定了肠膜明串珠菌LN和植物乳杆菌JL的增殖培养基，而且 10℃条件下，耐低温乳酸菌 3m－1(Lactobacillusplantarum)和8m－9(Leuconostoc mesenteroides)在上述培养基中培养72h，活菌数分别可达6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，较白菜汁基础培养基分别提高了6.1倍和10.4倍，但与采用MRS培养基的活菌数相近，区别于刘丹［17］等研究了37℃条件下，以MRS培养基为对象，通过玉米浆代替蛋白胨的同时添加番茄汁优化了嗜酸乳杆菌的增殖培养基，其不仅满足了乳酸菌的生长获得了高活菌数，而且节约成本的同时简化了培养基成分，从而缩减了代谢产物的积累使得菌体更易分离，同时选用白菜汁培养基能够使泡菜乳酸菌菌株快速适应发酵的环境。研究结果对制备低温乳酸菌发酵剂具有指导意义，同时也为低温发酵泡菜的生产奠定了基础。

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