刘欢,陈剑锋,王静,袁子民

(1.辽宁中医药大学,大连 116600;2.辽宁成大方圆医药有限公司,沈阳 110005)

高效液相色谱法同时测定肉豆蔻麸煨前后肉豆蔻木脂素和去氢二异丁香酚的含量*

刘欢1,陈剑锋2,王静1,袁子民1

(1.辽宁中医药大学,大连 116600;2.辽宁成大方圆医药有限公司,沈阳 110005)

目的 建立高效液相色谱法同时测定肉豆蔻麸煨前后肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的含量测定方法。方法色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水梯度洗脱,检测波长270 nm,柱温25℃,流速1.0 mL·min-1。结果肉豆蔻木脂素在10.24～61.44 μg·mL-1范围内线性关系良好,r=0.999 6,平均回收率为97.94% (n=6),RSD为2.01%。去氢二异丁香酚在3.0～18.0 μg·mL-1范围内线性关系良好,r=0.999 8,平均回收率为97.11% (n=6),RSD为2.17%。结论该方法简单、准确、重复性好,可用于同时测定肉豆蔻麸煨前后肉豆蔻木脂素和去氢二异丁香酚丁香酚的含量。

肉豆蔻;肉豆蔻木脂素;去氢二异丁香酚;色谱法,高效液相

肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟种仁,具有温中行气,涩肠止泻功效[1]。肉豆蔻的主要成分为挥发油、木脂素、脂肪油等。肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚是肉豆蔻中非挥发性成分,其中肉豆蔻木脂素具有抗氧化及肝保护作用,对肝脏药物代谢酶活性有一定程度的抑制作用,能够抑制肿瘤细胞生长和心血管平滑肌收缩[2-3],去氢二异丁香酚有较强的抑菌作用[3-4]。《中华人民共和国药典》2010年版中规定高效液相色谱法测定肉豆蔻药材中的去氢二异丁香酚的含量作为质量控制依据,亦有研究报道采用高效液相法测定肉豆蔻衣中的去氢二异丁香酚的含量作为其质量控制依据[5],而对肉豆蔻木脂素的含量测定较少。因此笔者在本实验中对肉豆蔻、麸煨肉豆蔻、切片后麸煨肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚含量同时进行测定,考察麸煨前后含量变化,为肉豆蔻、麸煨肉豆蔻炮制机制的深入研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Sartorius CP225D十万分之一分析天平(德国);SG3300型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司);电子分析天平(SHIMADZU CORPORATION);Agilent 1100高效液相色谱仪(chemistation system工作站);Agilent 1100可变波长检测器;Aglient 1100系列泵系统;日普利PRL-D2000柱温箱。

1.2 试药 肉豆蔻(浙江中医药大学饮片厂提供,产地:印度尼西亚,批号:090414),经辽宁中医药大学贾天柱教授鉴定为肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristica fragransHoutt.)的干燥成熟种仁;麸煨肉豆蔻(按《中华人民共和国药典》2010年版方法炮制)、麸煨肉豆蔻片(肉豆蔻切成厚片后麸煨)自制。去氢二异丁香酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号:11838-201102);肉豆蔻木脂素对照品(上海时代生物科技有限公司,批号:12051001);甲醇为色谱纯,乙醇为分析纯,水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)。流动相:A相为甲醇,B相为水;梯度洗脱程序:0～5 min,A:60%～62.5%,B:40%～37.5%;～10 min,A:62.5%～65%,B:37.5%～35%;～25 min,A:65%～70%,B:35%～30%;～35 min,A:70%～78%,B:30%～22%;～45 min,A: 78%～80%,B:22%～20%;～50 min,A:80%～90%,B:20%～10%。流速:1.0 mL·min-1;检测波长:270 nm;柱温:25℃;进样量:10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 取肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚对照品适量,精密称定,分别置于100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成含肉豆蔻木脂素204.8 μg·mL-1、含去氢二异丁香酚60.0 μg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 分别称取肉豆蔻、麸煨肉豆蔻、麸煨肉豆蔻片粉末(过筛孔内径0.85 mm筛)0.25 g,精密称定,分别置具塞锥形瓶中,精密加入80%乙醇25 mL,称定重量,超声(功率250 W,频率30 kHz)处理30 min,放冷,再称定质量,用80%乙醇补足减失的质量,摇匀,用微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。

2.4 线性关系考察 分别精密量取肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚对照品溶液各25 mL,置50 mL量瓶中,混匀。精密量取混合对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0, 5.0,6.0 mL分别置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得不同浓度的系列对照品溶液。按照“2.1”项色谱条件依次进样10 μL,以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程分别为:肉豆蔻木脂素Y=4.391X+1.571(r=0.999 6),去氢二异丁香酚Y=64.493X+5.447(r=0.999 8)。其结果表明,肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚分别在10.24～61.44,3.0～18.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 取同一肉豆蔻供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下,连续进样6次,记录峰面积,计算肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的RSD分别为1.75%,1.68%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 取同一肉豆蔻粉末,过筛孔内径0.850 mm(20目)筛,按“2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液,测定肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的含量。其平均含量分别为2.357 0,1.134 1 mg·g-1, RSD分别为2.41%,1.81%。表明该法重复性良好。

2.7 稳定性实验 取同一肉豆蔻供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下,分别在0,2,4,6,8 h进样10 μL,记录峰面积,计算肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的RSD分别为2.17%,2.07%。表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 加样回收率实验 精密称取同一肉豆蔻粉末(已知肉豆蔻木脂素含量为0.239 6%,去氢二异丁香酚含量为0.109 0%)0.125 g各6份,分别精密加入肉豆蔻木脂素对照品溶液(浓度为204.8 μg·mL-1) 1.5 mL、去氢二异丁香酚对照品溶液(浓度为60.0 μg·mL-1)2.5 mL,再精密加入80%乙醇21.5 mL,其余按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液。按照“2.1”项色谱条件下操作,测定,结果见表1。肉豆蔻木脂素平均回收率97.94%,RSD=2.01%;去氢二异丁香酚平均回收率97.11%,RSD=2.17%。

2.9 样品含量测定 分别取肉豆蔻、麸煨肉豆蔻、麸煨肉豆蔻片粉末,按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液,在同一色谱条件下测定肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的含量。结果见表2,色谱图见图1。

3 讨论

将肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚对照品溶液分别在200～400 nm进行扫描,肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚在220,270 nm处均有强吸收,综合考虑分离度及溶剂影响,选择270 nm作为紫外测定波长。本实验曾考察过提取溶剂(甲醇、80%乙醇)和提取时间(10, 20,30 min)对肉豆蔻中肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的含量影响,结果表明80%乙醇超声30 min,对肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚的提取效果较好。本方法简单且重复性较好。本实验分别对肉豆蔻、麸煨肉豆蔻、麸煨肉豆蔻片作含量测定,结果麸煨后肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚含量均降低,其中麸煨对肉豆蔻木脂含量影响较小,对去氢二异丁香酚含量影响较大。

表1 肉豆蔻木脂素和去氢二异丁香酚加样回收率实验结果Tab.1 Recoveryresultsofnutmeglignanand dehydrodiisoeugenol

表2 肉豆蔻木脂素、去氢二异丁香酚含量测定结果Tab.2 Results of content determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol %,n=3

1.肉豆蔻木脂素;2.去氢二异丁香酚图1 对照品(A)、肉豆蔻(B)、麸煨肉豆蔻(C)和麸煨肉豆蔻片(D)高效液相色谱图1.nutmeg lignan;2.dehydrodiisoeugenolFig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)、nutmeg(B)、nutmeg roasted with wheat bran(C)and sliced nutmeg roasted with wheat bran(D)

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:212.

[2] SOHN J H,HAN K L,KIM J H,et al.Protective effects of macelignan on cisplatin-induced hepatotoxicity is associated with JNK activation[J].Biol Pharm Bull,2008,31(2): 273-277.

[3] 李飞,杨秀伟,程燕,等.肉豆蔻木脂素的体外代谢初步研究[J].中国新药杂志,2008,17(7):560-564.

[4] 袁子民,贾天柱,张艳秋,等.商品肉豆蔻药材的指纹图谱研究[J].中国中医药信息杂志,2008,15(9):41-42.

[5] 王航宇,王书云,李国玉,等.高效液相色谱法测定肉豆蔻衣中去氢二异丁香酚含量[J].医药导报,2013,32(5): 647-649.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.025

Determination of Content of Nutmeg Lignan and Dehydrodiisoeugenol in Nutmeg by HPLC

LIU Huan1,CHEN Jian-feng2,WANG Jing1,YUAN Zi-min1
(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China;2.Liaoning Chengda Fangyuan Medicine Chained Limited Company, Shenyang 110005,China)

Objective To develope a high performance liquid chromatograph(HPLC)method for simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after processing of nutmeg.MethodsThe column was Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was methanol-water in a gradient elution mode.The UV detection wave length was 274 nm.The column temperature was 25℃.The flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsNutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol had a good linear correlation in ranges of 10.24-61.44 μg·mL-1(r=0.999 6)and 3.0-18.0 μg·mL-1(r=0.999 8),respectively.The average recovery rates were 97.94%(RSD=2.17%)and 97.11%(RSD=2.17%).Conclusion The method is simple,accurate,reproducible,and can be used for the simultaneous determination of nutmeg lignan and dehydrodiisoeugenol before and after the processing of nutmeg.

Nutmeg;Nutmeg lignan;Dehydrodiisoeugenol;Chromatograph,high performance liquid

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1070-03

2013-10-24

2013-12-31

*国家自然科学基金资助项目(81274084)

刘欢(1989-),女,辽宁朝阳人,在读硕士,研究方向:药物分析。电话:(0)15842696224,E-mail:liuhuan.cat@ 163.com。

袁子民(1975-),男,辽宁朝阳人,副教授,博士,研究方向:新药研究与开发及中药炮制机制研究。电话: 0411-85890145,E-mail:yuanzmin@163.com。