摘要：本文以瘦柄红石蕊Cladonia macilenta次生代谢产物biruloquinone为对象，研究其体外BACE酶抑制活性。结果显示，biruloquinone对BACE的抑制与浓度正相关，浓度为100微克/毫升时，抑制率达68.36%，对酶活抑制50%的浓度（IC50）为62.3微克/毫升（191微米）。

关键词：瘦柄红石蕊；Biruloquinone；BACE抑制活性

中图分类号：R96 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-06-28-1

瘦柄红石蕊（Cladonia macilenta Hoffm.）是地衣门（Lichenes）、子囊衣纲（Ascolichens）、石蕊科（Cladoniaceae）、石蕊属（Cladonia）的一种朽木生地衣。据报道，罗姮[1]等首次从C. Macilenta中分离出一种自然界罕见的菲醌化合物biruloquinone。该类化合物已被发现具有多种重要的活性，如丙肝肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂活性、CD45抑制剂活性等[2]，但对其BACE抑制剂活性研究未见报道。在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中，β分泌酶（BACE1）是产生淀粉样β蛋白（Aβ）的关键分子[3]，BACE1抑制剂的研发在AD治疗方面已成为社会及医药工业界关注的热点之一[4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株：瘦柄红石蕊采集于云南省，地衣标本存放于昆明植物研究所标本馆（CH050136），地衣体经内生真菌分离得到的紫色C.macilenta LFF保存于韩国地衣资源银行（KOLABIC），国立顺天大学。

试剂药品：β-分泌酶（BACE）抑制剂筛选分析试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），其余化学试剂均为国产分析纯。

主要仪器：旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），Synergy HT多功能微孔板酶标检测仪（美国Bio Tek公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 Biruloquinone的提取和分离 将地衣型真菌瘦柄红石蕊的菌丝体接种于PDB培养基中（5瓶×300毫升/1000毫升三角瓶），15℃、150转/分避光培养30天（发酵液呈深紫色），将全部1.5L发酵液，用乙酸乙酯等体积萃取24小时。将有机层通过Whatman No.1定性滤纸除去菌丝体。重复两次该过程，并将提取液合并，40℃真空浓缩至500毫升。将浓缩的提取物过硅胶柱（230～400目，3.5×80厘米）纯化，用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（90∶20∶2，v/v，4升）洗脱，得到暗紫色组分（980毫升），将该组分集中在真空30℃浓缩，获得110mg biruloquinone固体粗提物。然后将粗提物用氯仿-甲醇重结晶法纯化（1：1，v/v），得到35mg暗紫色的biruloquinone晶体。

1.2.2 Biruloquinone的体外BACE抑制实验 样品准备：将biruloquinone配成6.25，12.5，25，50，75，100微克/毫升的质量浓度。BACE酶抑制率的测定：（1）向背景值检测孔加95微升检测缓冲液和2.5微升 80%乙醇溶液；（2）向空白对照孔加92.5微升检测缓冲液，2.5微升 80%乙醇和2.5微升 BACE；（3）向样品检测孔分别加95微升检测缓冲液，2.5微升不同浓度的biruloquinone和2.5微升 BACE；（4）向所有检测孔加2.5微升酶作用底物（10微米），轻轻震荡混匀，室温孵育40 分；（5）使用酶标仪以激发光（excitation，ex）340nm-发射光（emission，em）500nm检测荧光强度；（6）每个检测孔3个重复，根据以下公式计算平均抑制率：

抑制率I（%）=[（A2-A3）/A3-A1]×100%

其中：A1为缓冲液背景值；A2为抑制前酶活性；A3为抑制后剩余酶活性。

2 结果与讨论

Biruloquinone体外BACE抑制活性：本实验采用重组人BACE-1，荧光底物含有一个强荧光7-甲氧基香豆素基团，BACE能切割荧光基团和猝灭基团之间的肽酶活性，使荧光增强。因此可以根据荧光的变化值来判断样品对BACE的抑制活性。从图1可知，biruloquinone对BACE的抑制与浓度正相关，抑制率随浓度增加而迅速提高，对酶活抑制50%的浓度（IC50）为62.3微克/毫升（191微米）。在最大浓度为100微克/毫升时，抑制率达68.36%，由此可知，biruloquinone具有较强的BACE抑制活性。

图1 Biruloquinone对BACE抑制作用曲线

3 结语

Biruloquinone具有较强的BACE抑制剂活性，在最大浓度为100微克/毫升时，清除率可达68.36%（IC50=62.3微克/毫升）。由此可见，biruloquinone具有一定的治疗AD的能力，这种特性为将瘦柄红石蕊的次生代谢产物biruloquinone开发成为多靶点的抗AD的天然药物提供科学依据。

参考文献

[1] Biruloquinone ， an Acetylcholinesterase Inhibitor Produced by Lichen-Forming Fungus Cladonia macilenta[J].Microbiol. Biotechnol，2013， 23（2）：161-166.

[2] 魏其艳，罗应冈，张国林.菲醌的生物活性[J].天然产物研究与开发，2005，17（5）：665-668.

[3] Cai H， Wang Y， McCarthy D， et al. BACE1 is the major β-secretase for generation of Aβ peptides by neurons[J]. Nat Neurosci， 2001， 4（3）： 233-234.

[4] 周金武，程肖蕊，程军平，等.BACE1抑制剂分子水平高通量筛选体系的建立[J].国际药学研究杂志，2010，37（4）：302-309.

作者简介：代欢欢，吉林农业大学，硕士研究生，研究方向：菌物生态学。