彭玉婉程龙飞贺小进杨晓玉王 晶

魏兆莲1周 平1宋 兵1王彬彬3马 旭3**曹云霞1**

1. 安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民医院妇产科; 3. 国家人口计划生育科研所; 4. 江苏省人民医院生殖医学中心

SCNN1G基因和IL1B基因多态性与汉族男性先天性双侧输精管缺如的相关性研究*

彭玉婉1,2程龙飞3贺小进1杨晓玉4王 晶3

魏兆莲1周 平1宋 兵1王彬彬3马 旭3**曹云霞1**

1. 安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心（合肥 230032）; 2. 合肥市第一人民医院妇产科; 3. 国家人口计划生育科研所; 4. 江苏省人民医院生殖医学中心

目的研究非电压门控钠离子通道基因SCNN1G以及IL1B基因与先天性双侧输精管缺如（CBAVD）间的关系。方法通过直接测序和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）方法检测基因多态性位点rs5735（SCNN1G基因）和rs3917356（IL1B基因）在109例病例和103例对照人群中的基因型频率的分布。结果两个单核苷酸多态性（SNP）位点在病例-对照组中的等位基因、基因型频率分布差异无显著性（P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356）结论SCNN1G基因（rs5735）、IL1B基因（rs3917356）均未发现与CBAVD之间存在明显的关联性。

输精管/畸形; 囊性纤维化跨膜转导调节因子; 基因

囊性纤维化（CF）是常见的染色体隐性遗传病，影响人体多种器官形成[1]。先天性双侧输精管缺如（CBAVD）是其生殖器表现形式，几乎95%的男性CF患者都存在先天性双侧输精管缺如[2]。囊性纤维化跨膜转导因子（CFTR）是CF的主要致病基因，近年来有些学者研究发现在CF患者中具有相同CFTR基因突变确存在着不同的表型[3]，之后又有些学者推测CBAVD致病基因除了CFTR基因很可能存在其他基因变异[4]。Stanke等[5]报道编码上皮钠离子通道（ENaC）γ亚单位的非电压门控钠离子通道（SCNN1G）基因与CF表型有相关性。ENaC控制调节上皮细胞的盐水平衡，共包括3个亚单位：α-ENaC、 β-ENaC和γ-ENaC[6]。ENaC在促进胎肺转化为成熟肺过程中，起着关键的液体平衡调节机制[7]。且ENaC通道蛋白与CFTR通道蛋白在分子水平上有相互关联[8]，SCNN1G基因多态性位点rs5735和rs5723与CF病发生相关。在非洲CF患者中，也发现了ENaC和CFTR两个基因的突变[9]。细胞因子白介素1b（IL1B）基因编码促炎性细胞因子IL1β，是另外一个CF的候选基因[10]。IL1B基因是IL-1家族基因之一。在体外培养的人和小鼠肺上皮细胞中发现IL1B基因在气道促炎症信号中起到关键作用[11]。进一步发现与IL-1B基因相关SNP（rs3917356）与CF相关[12]。本研究是首次在汉族先天性双侧输精管缺如人群中检测SCNN1G基因、IL1B基因的等位基因、基因型频率的分布情况，以探究其与CBAVD发生的关联性。

材料与方法

本研究包括病例组109例CBAVD患者和对照组103例健康男性。病例组与对照组来自于安徽医科大学第一附属医院和江苏省人民医院生殖医学中心2010年6月至2012年12月期间男科门诊患者。CBAVD患者由至少两名高年资男科医生结合生殖器体检、生殖系统超声检查、精液常规及生化检查和性激素检查等做出诊断，所有患者行睾丸精子抽吸术（ TESA ）或经皮附睾精子抽吸术（ PESA ）发现成熟精子。全部患者进行Y染色体微缺失，染色体核型（46,XY）检查分析，均正常。所有参与者均签署研究知情同意书，并通过安徽医科大学生物医学研究伦理委员会审查（编号：2008035）。

一、实验方法和具体步骤

采用基因组DNA提取试剂盒（Qiagen，德国Hilden）提取外周静脉血基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计（ND -2000，威尔明顿，DE）进行DNA浓度和纯度测定并标准化至25～30ng/μL。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分析和直接测序法检测SNP位点rs5735和rs3917356。PCR扩增引物分别为：rs5735:5'-TCGCCACCTTCTAGCTGACT-3'（正向），5'-CATCTGGGCTCACTGCAAC-3'（反向），和rs3917356:5'- CGCTTTGGACCTCATCTG -3 '（正向），5'- GGCACACAGCAGGTTAGAG -3'（反转）。热循环条件：rs5735:预变性：95℃ 3min，40个循环（变性95℃ 40s，退火 63.1℃ 40s，延伸72℃40s），最后终延伸72℃ 7min；rs3917356：预变性95℃ 3min，40个循环（95℃ 50s，57℃ 50s，72℃55s），终延伸72℃ 7min。rs5735 PCR产物经过Bam HI （ New England Biolabs公司NEB ，北京，中国）酶切37℃ 4h。RFLP产物通过4%琼脂糖凝胶电泳最终确定CT杂合子基因型三个片段分别为497bp、145bp和642bp，CC纯合子为497 bp和145 bp两个片段，TT纯合子为642 bp一个片段。 rs3917356通过直接测序确定基因型。

二、统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，对CBAVD病例和对照组之间SCNN1G和IL-1B等位基因和基因型频率进行标准的卡方分析及Hardy-Weinberg平衡（HWE）测试。采用t检验和方差分析进行临床数据比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

表1显示两组间年龄、嗜酒与否、体质量指数（BMI）存在统计学差异（P＜0.01），而吸烟与否、吸烟年限、接触放射线史、左右睾丸体积均未见明显统计学差异（P＞0.05）。

表2显示rs5735位点的3种基因型CC、CT、TT及两种等位基因C、T频率分布在两组中无明显的统计学差异（P＜0.05），rs3917356位点的3种基因型AA、AG、GG及两种等位基因A、G频率分布在两组中亦无明显的统计学差异（P＜0.05）。

2004年Helve等明确在肺疾病中，所有ENaC 亚单位mRNA表达水平均下降，其中以SCNN1G mRNA表达水平下降最为显著[13]。囊性纤维化跨膜转导因子蛋白（CFTR）和ENaC在控制调节气道表面液体平衡方面起着拮抗性作用，两者均通过对气道上皮水和细胞内钠离子和氯离子分泌和吸收进行调节[14]。2009年Joos等[15]对非洲55例CF患者的SCNN1G等基因进行关联性分析，推测SCNN1G基因很可能是参与了CF患者的基础缺陷以及炎症反应。因此，ENaC蛋白通道是导致CF基础缺陷的重要调节机制。

表 1 两组一般临床资料比较 n(%) （±s）

表 1 两组一般临床资料比较 n(%) （±s）

注: 与对照组比较,*P＜0.01;**P＜0.05

项目 对照组(n=103) 病例组(n=109)年龄(岁) 32.80±4.66 29.80±5.01*吸烟是 56(54.37) 56 (51.37 )否 47(45.63) 53 (48.63)吸烟年限 4.62±5.13 4.31±5.29酗酒是 41(39.81) 9 (8.26)*否 62(60.19) 100 (91.74)放射线是 4(3.88) 2 (1.83)否 99(96.12) 107 (98.17)化学物质接触史是 1(0.97) 1 (0.91 )否 102(99.03) 108(99.09)体质量指数 24.31±3.17 23.14±3.41**右侧睾丸体积(mL) 14.88±2.64 15.28±3.21左侧睾丸体积(mL) 14.81±2.72 15.17±3.3

表2 两组rs3917356和rs5735位点基因型分布差异

IL-1B基因被证明在肺部的自发性免疫反应中起到至关重要的作用，2009年Levy等[16]通过对808例CF患者进行IL-1基因多态性检测，结果发现IL-1B基因有阳性多态性位点（rs1143643、rs1143639），Levy等推测这些阳性位点可能是通过改变铜绿假单胞菌感染的敏感性来影响肺部功能的，同时这些IL-1B基因阳性多态性位点可能引起超敏反应来抵抗感染，其负面的影响即损伤了肺功能。2011年Labenski等[17]继续探讨了IL-1B基因多态性与CF之间的关联，研究发现rs3917356和rs4848306与CF肺疾病的严重性相关，引人瞩目的本次研究与2009年Levy等的研究样本完全不同，基因检测方法也不同，但是这4个SNPs均在相同的基因片段内，更加确定了IL-1B基因多态性与CF之间有着一定的关联性。此外，功能分析发现在鼻病毒感染的人鼻上皮细胞（HNECs）中，IL-1β会增加α-ENaC在肺中表达[18]，也可以激活核因子-κB（NF-κB）途径，以改善气道细胞CFTR表达量[19]。

依据CBAVD与CF有着共同的遗传学基础，我们推测SCNN1G基因及IL1B基因可能同样与CBAVD有关。我们选取了与CF患者中密切关联且在中国人群中符合MAF＞0.05的多态性位点rs5735和rs3917356。本研究是首次在中国汉族CBAVD患者中检测rs5735、rs3917356位点基因频率分布情况。我们利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）方法，对最后成功分型的109例病例组和103例对照组进行基因型检测，结果发现两位点基因型频率及等位基因频率分布在两组之间均无统计学差异（P＞0.05）。这一结果与既往的研究结果不同[5,17]，我们推测可能原因为：（1）不同人种的基因异质性差异；（2）基因与基因之间的相互作用，SCNN1G、IL-1B和CFTR3个基因间可能存在共同作用的机制导致CBAVD的发生；（3）本研究中样本数量有限，结果可能存在一定偏倚。在今后的研究中可通过进一步扩大样本验证。

综上所述，本研究首次在汉族CBAVD人群中检测SCNN1G、IL-1B基因型分布情况，为进一步探究CBAVD致病因素提供线索。

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（2014-03-28收稿）

Association ofSCNN1GandIL1Bpolymorphisms with congenital bilateral absence of the vas deferens in the Chinese Han population*

Peng Yuwan1,2, Cheng Longfei3, He Xiaojin1, Yang Xiaoyu4, Wang Jing3,
Wei Zhaolian1, Zhou Ping1, Song Bing1, Wang Binbin3, Ma Xu3**, Cao Yunxia1**1. Reproductive Medicine Center, Department of Obstetrics and Gynecology, the First Aff liated Hospital of Anhui Medical
University, Hefei 230032, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, the First People's Hospital of Hefei; 3. National Research Institute for Family Planning; 4. Reproductive Medical Center of Jiangsu Province People's Hospital

Ma Xu, E-mail: ADgenetics@gmail.com; Cao YunXia, E-mail: caoyunxia6@126.com

ObjectiveTo investigate whetherSCNN1GandIL-1βpolymorphisms were associated with the development of congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD).MethodsA total of 222 Han Chinese males, including 109 CBAVD and 103 controls were recruited in the study.IL-1B(rs3917356) and sodium channel nonvoltage-gated 1 (SCNN1G, encoding the ENaC γ-subunit) (rs5735) polymorphisms were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and direct sequencing.ResultsNo signif cant differences in gene locus frequency of either SNP were found between patients with CBAVD and the control (P=0.2410,P=0.1701 rs5735;P=0.5564,P=0.0959 rs3917356, respectively).ConclusionThese results suggest that SNPs of SCNNIG gene and IL1B gene may not be associated with the development of CBAVD.

vas deferens/abnormalities; cystic f brosis transmembrane conductance regulator; genes

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.002

R 697.25

资助: 安徽高校省级自然科学基金项目（KJ2011Z166）

**共同通讯作者, 马旭,E-mail: ADgenetics@gmail.com; 曹云霞, E-mail: caoyunxia6@126.com