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(青岛大学附属医院儿内科，山东 青岛 266003)

肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒科[1]，主要引起手足口病，大多数病情轻微，具有自限性。EV71与肠道病毒家族其他成员相比，具有明显的嗜神经性，易引起无菌性脑膜脑炎、脑干脑炎、脑炎等中枢神经系统疾病，严重者可致肺水肿、肺出血危及病儿生命[2-3]。自1969年首次报道以来，在世界范围内已引起多次爆发和流行[4]，严重威胁儿童健康。目前对于EV71致感染的机制，尤其中枢神经系统感染的遗传易感因素尚未明确。白细胞介素10(IL-10)可抑制炎症递质的产生，具有强有力的免疫及炎症抑制功能，在多种病毒感染的发生发展中起着重要的作用[5-6]。研究显示，IL-10基因启动子区-592C/A(IL-10-592C/A)位点为转录因子结合位点，通过影响IL-10的转录水平进而影响IL-10的表达及生物活性[7]。本课题通过对IL-10-592C/A位点的基因多态性进行分析，以进一步了解EV71脑炎的遗传易感因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年6月—2012年3月，青岛大学医学院附属医院和青岛市妇女儿童医院住院的EV71感染病儿共103例，男63例，女40例；年龄为1.3～7.5岁；其中轻症病儿75例，重症[8]病儿28例。诊断均符合中华人民共和国卫生部制定的《手足口病诊疗指南(第2010版)》的标准，且重症病儿RT-PCR检测急性期粪便及脑脊液EV71病毒核酸阳性[9]。正常对照组135例，男83例，女52例；年龄2.7～8.3岁；为同期于儿童保健科体检且临床无感染症状的儿童，血常规及生化指标检查均在正常参考范围内。

1.2 实验方法

1.2.1DNA提取 入院时采集病儿静脉血2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃暂存备用。采用Omega公司 (美国)全血DNA提取试剂盒，提取抗凝全血基因组DNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2Hardy-Weinberg平衡定律检测 根据Hardy-Weinberg平衡定律对EV71感染组与对照组IL-10-592C/A位点基因进行检验，P>0.05，提示两组人群符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

1.2.3IL-10-592C/A位点基因多态性检测 IL-10-592C/A位点引物由上海天昊生物科技公司设计完成。取DNA样本1 μL，加入10 g/L的琼脂糖后进行电泳，对其样本进行质量检查以及浓度估计，然后将样本稀释到工作浓度10 μg/L。取iMLDRTM多重SNP分型试剂盒中的多重PCR引物混合物1 μL、2×PCR Master mix 5 μL、样本DNA 1 μL、ddH2O 3 μL混匀，进行PCR扩增反应，并纯化。将试剂盒中的10×连接缓冲液2 μL、高温连接酶0.2 μL、连接引物混合液1 μL与纯化后多重PCR产物3 μL、ddH2O 3.8 μL混匀。然后94 ℃ 1 min,56 ℃ 4 min，共 35 个循环；最后4 ℃下保存。取0.5 μL稀释后的连接产物，与0.5 μL Liz 500 Size Standard荧光内标及9 μL高度去离子甲酰胺混匀混匀，95 ℃变性5 min后上测序仪(ABI3130XL)进行测序。收集的原始数据用GeneMapper 4.0(美国Applied Biosystems公司)进行分析,采用连接产物的荧光标记特点及长度区分等位基因及不同位点(由上海天昊生物科技公司完成)。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包进行统计分析。两组间基因型和等位基因频数分布比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

EV71感染病儿与对照儿童均存在IL-10基因多态性，IL-10-592C/A位点基因型分布均以CC型最为常见，等位基因型以C型多见，AA基因型分布频率低，将AA基因型与AC基因型合并进行分析。EV71感染组IL-10-592C/A位点基因型分布为CC型74例、AC+AA型29例，等位基因分布为C型148例、A型58例；对照组该位点基因型分布CC型为97例、AC+AA型为38例，等位基因分布为C型226例、A型44例。轻症组CC型60例、AC+AA型15例，等位基因分布为C型120例、A型30例；重症组CC型14例、AC+AA型14例，等位基因分布为C型28例、A型28例。EV71感染病儿IL-10-592C/A位点基因型CC、AC+AA分布与对照组比较差异无显著性(P>0.05)，但EV71感染重症组病儿基因型AC+AA的分布与轻症组病儿比较差异有显著性(χ2=9.071，P<0.05)；EV71感染组A等位基因分布频率与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。但重症组A等位基因频率分布与轻症组比较差异有显著性(χ2=18.143，P<0.05)。

3 讨 论

EV71致儿童中枢神经系统损害可引起脑炎、无菌性脑膜脑炎、脑脊髓炎及急性迟缓性麻痹等多种与神经系统相关的疾病[10]，致死率及致残率较高。目前，EV71致中枢神经系统感染的机制尚未完全明确，不同个体感染EV71后其临床表现、病情经过及预后迥异，造成这种差异的原因除了病毒本身的因素外，还包括不同宿主基因组对于病毒的易感性及免疫状态的差异。因此，从宿主基因角度探讨EV71致中枢神经系统感染的机制，可以进一步明确EV71易感性的遗传学标志。本研究对EV71感染病儿103例及健康儿童135例外周血白细胞中IL-10-592C/A位点的基因型检测结果显示，IL-10-592C/A位点AC+AA基因型及A等位基因为在EV71感染后发展为重症脑炎的易感基因，结果提示A等位基因频率增高与EV71感染及感染后致严重的中枢神经系统并发症相关，而该位点CC基因型携带者感染EV71后不易发展为重症脑炎。

EV71脑炎是脑实质的炎症性疾病，机体的炎症反应及免疫状态的基因差异对疾病的发生发展及预后起着重要的作用，炎症因子尤其是具有多效能的细胞因子IL-10在机体炎症反应中起着重要作用。由于IL-10是细胞因子网络的枢纽之一且具有抗炎因子作用，在EV71脑炎的感染及疾病的转归中发挥一定作用。研究显示，IL-10-592C/A位点为STAT3转录激活子结合位点，此位点存在C→A的突变，它可能为一种功能性的突变，其变异可使IL-10的转录水平下调，mRNA转录活性降低[7]，导致IL-10合成减少，不能有效抑制EV71脑炎脑实质的炎症反应。故IL-10-592C/A位点基因型为AC+AA者与基因型为CC者比较，合成的IL-10浓度低且活性低，IL-10启动子区-592C/A位点C→A的基因多态性可导致IL-10的表达水平或其活性的改变，血液中低浓度的IL-10不能起到有效地抑制炎症反应的作用，导致白细胞活化增强，血管通透性更加明显，致脑实质的炎症反应进一步加剧，引起脑实质更明显的炎症性损害。

本文研究结果显示，IL-10-592C/A位点基因型AC+AA携带者及A等位基因为EV71感染后发展为重症的危险因素，而基因型CC及C等位基因为病儿不易致重症的保护基因。但由于遗传、机体免疫功能状态及病毒毒力及环境因素共同作用于机体致EV71感染，要确切了解IL-10的基因多态性与EV71致中枢神经系统感染的机制，尚需更深入的研究。

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