蒋 磊，赵 翠，沈 强，郭 浩，王秋菊，常维山

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安 271000；2.莱芜菁华药业，莱芜 271100）

·简报·

水貂IgG Fc段基因及抗原性分析

蒋 磊1，赵 翠1，沈 强1，郭 浩1，王秋菊2，常维山1

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安 271000；2.莱芜菁华药业，莱芜 271100）

根据GenBank上发布的水貂IgG中Fc段的序列（L07789.1），设计合成1对引物用于扩增水貂Fc段基因。从水貂脾脏中提取总RNA，RT-PCR扩增水貂Fc段基因，获得大小约606 bp的片段，将其连接T载体并测序。然后进行遗传进化分析，在此基础上利用Western blot进行抗体杂交试验。结果显示水貂IgG Fc与Fc犬核苷酸序列同源性为85.0%，氨基酸序列同源性为80.5%。Western blot显示水貂IgG重链可以和抗犬IgG有效结合，遗传进化分析得出哺乳动物中水貂与犬IgG Fc的亲缘关系最近。通过以上分析和相关文献得出用犬的诊断试剂可以检测水貂疾病，或用犬的抗血清进行水貂疾病治疗。

水貂；IgG；Fc基因；遗传进化分析；Western blot

近年来我国特种动物的养殖规模在不断地扩大，水貂的养殖量也达到了一定的规模，但是目前流行于水貂群体之间的疾病多为病毒性疾病，如犬瘟热、犬细小病[1]。目前水貂专用的病毒检测试剂盒和胶体金检测试纸条还没有普及，这样就给水貂疾病的快速检测带来了不便。犬的几种病毒性疾病同样发生在水貂身上，而犬疾病的诊断试剂市场上已趋完善，能否利用犬病毒性疾病的检测试剂来检测水貂身上的相应疾病？对此进行研究具有重要现实意义。

免疫球蛋白G（IgG）Fc段是抗体C区重要的结构域[2,3]，与抗体的种属特异性有关。它可以介导抗原抗体复合物通过Fc受体与抗原呈递细胞结合[4]，并在受体的介导下促进抗原呈递细胞对外来抗原的吞噬，进而激发机体对特定抗原的细胞免疫反应[5,6]。本研究从水貂脾脏内提取RNA，对水貂IgG Fc基因进行了克隆，并进行了遗传进化分析，利用Western blot检测了水貂、犬、小鼠和鸡IgG的交叉反应性，为指导临床水貂疾病的免疫检测以及血清学治疗提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种和载体E.coliDH5α感受态为本实验室保存；pEasy-T1载体购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自生工生物工程有限公司；反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司；2 K、2 K Plus II DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；2×EsTaqMaster Mix试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；犬、水貂、鸡、小鼠IgG和兔抗犬IgG购自北京索来宝生物科技有限公司；HRPDAB底物显色试剂盒购自Tiangen生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank上发表的美洲水貂IgG基因序列（序列号∶ L07789.1），设计1对引物，F∶ 5'-CTCGAGCAGTCTTCATGTTCCCCC-3'，R∶ 5'-AAGCTTGATGGTCTTCTGCGTGTGGT-3'。

1.2.2 水貂脾脏总RNA的提取及RT-PCR 参照试剂盒说明提取水貂总RNA，然后反转录成cDNA，反转录体系参照试剂盒说明，进行RT-PCR。反应结束后取50 μL PCR产物于1 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察然后进行胶回收（参照试剂盒说明）。将回收产物与pEasy-T1载体结合，构建成pEasy-T1-Fc质粒，连接后转化E.coliDH5α，挑选阳性菌落，摇菌后提取质粒，双酶切鉴定后，送金斯瑞生物工程有限公司测序。测序结果用NCBI网站上Blast软件进行比较分析。

1.2.3 多种软件对水貂IgG Fc段序列进行序列分析及比较 利用DNAMAN将测序获得的Fc序列分别与GenBank中的其他几种哺乳动物的Fc序列进行核苷酸和氨基酸同源性比较分析。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot分析 将不同动物的IgG（Y）进行定量稀释，然后把样品和Loading Buffer按1∶1加入沸水中，煮样10 min。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，湿法转印过夜；5%脱脂奶粉封闭过夜，TBST漂洗2次，每次5 min；兔抗犬IgG稀释200倍，加入10 mL在摇床上慢慢摇动，室温孵育3 h；TBST漂洗10 min共5次，暗室HRP-DAB显色3 min后观察。

2 结果与讨论

2.1 水貂Fc基因的扩增及测序结果用试剂盒提取水貂总RNA反转录成cDNA然后进行PCR扩增，扩增出一条606 bp的条带，其大小与预期结果相一致（图1）。测序结果显示目的片段大小为606 bp，编码202个氨基酸。

图1 水貂 Fc RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplif ed result of mink Fc gene

2.2 水貂IgG Fc段氨基酸序列同源性比较

图2 水貂氨基酸序列比对Fig .2 Alignment of mink’s amino acid sequence

2.3 不同动物Fc片段基因及氨基酸的遗传变异分析犬、水貂、小鼠、鸡Fc片段基因及氨基酸的遗传变异性见表1，测序结果与GenBank上收录的美洲水貂（L07789.1）核苷酸同源性为99.0%，氨基酸同源性为97.5%。异源动物中测序水貂的IgG重链Fc段核苷酸序列同源性与犬的最高达到85.0%，氨基酸序列同源性与犬的最高达到80.5%，与其他动物则相对较低。

表1 不同动物Fc片段基因及氨基酸的遗传变异分析Table 1 The genetic variation analysis of different animal’s Fc gene and amino acids

2.4 水貂IgG Fc段氨基酸序列系统进化树本试验扩增得到当地水貂IgG Fc段基因，并对其进行了遗传进化分析，得到了其与多种动物的序列比较图和进化树（图3）。基因和氨基酸分析表明，不同动物的IgG Fc段有一定的同源性，从进化树上看出哺乳动物和禽类分属两大枝，且水貂和犬亲缘关系最近。

图3 IgG Fc氨基酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of IgG Fc fragment’s amino acid sequence

2.5 SDS-PAGE和Western blot结果由Western blot可以的看出抗犬IgG酶标抗体可以与犬IgG重链和轻链反应，抗犬IgG酶标抗体与小鼠IgG重链有明显的交叉免疫反应、与水貂的IgG重链有一定程度的交叉免疫反应，与鸡的交叉免疫反应很弱。

图4 多种动物IgG（Y）的SDS-PAGE及Western blot检测Fig.4 SDS-PAGE and Western blot result of different animal’s IgG(Y)

Western blot结果证明犬类疾病抗体的试剂盒用来检测水貂疾病是可行的，临床实践中也证明用诊断犬犬瘟热、细小病毒的金标试纸可诊断水貂的相关疾病[7]。李景存等[8]也曾应用患犬瘟热康复犬的血清治疗水貂的犬瘟热。

抗体本身的抗原性，主要取决于抗体重链的Fc段。编码一个物种IgG重链恒定区的基因相对保守，因此分析不同动物IgG重链基因的同源性，可反映不同动物抗体本身的抗原性有无交叉。本试验通过多种软件分析和Western blot检测证明了犬用检测试剂盒是可以应用到水貂相关疾病的检测中。

[1] 顾文彬, 冯丽洁..水貂主要疫病的流行与防治[J]. 养殖技术顾问, 2010, (2)∶ 173.

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[8] 李景存, 高玉兰. 应用患犬瘟热康复犬血清治疗水貂犬瘟热[J]. 毛皮动物饲养, 1996, 3∶ 31.

GENETIC AND ANTIGENIC ANALYSIS OF FC REGION OF MINK IGG

JIANG Lei1, ZHAO Cui1, SHEN Qiang1, GUO Hao1, WANG Qiu-ju2, CHANG Wei-shan1
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271000, China; 2. Laiwu Essence Pharmaceutical Co., Ltd, Laiwu 271100, China)

Detection methods for distemper and canine parvovirus can be universal for dogs and minks according to cloning and phylogenetic analysis of Fc gene as well as reactivity of mink IgG in Western blot. In order to obtain a certain length of Fc segment gene, a pair of primers were designed based on Fc gene sequences of mink IgG (L07789) published in GenBank. Total RNA materials were extracted from spleens of minks and amplif ed in RT-PCR. The results showed that the Fc segment gene consisted of 606 bp. Amplif ed Fc fragment was then cloned into the vector PEasy-T1 and sequenced for phylogenetic analysis. Antibody hybridization test was performed in Western blot. The nucleotide sequence homology between mink and canine was 85.0% and amino acid sequence homology was 80.5%. The heavy chain of mink IgG reacted with anti-dog IgG in Western blot. It was concluded that the Fc gene of mink and dog IgGs had the closest relationship within mammalians based on genetic evolution. The results obtained from the preceding study and related literature conf rmed that dog and mink diseases could be mutually diagnosed and treated using the reagents of either dog or mink origin.

Mink; IgG; Fc gene; phylogenetic analysis; Western blot

S852.42

B

1674-6422（2014）02-0078-05

2013-08-01

山东省教育厅项目（J08LF60）

蒋磊，男，硕士研究生，预防兽医学专业

常维山，E-mail：wschang@sdau.edu.cn