不同透皮促进剂对祖师麻体外透皮吸收的影响

2014-04-11石晓峰

中成药 2014年3期

关键词：促进剂丙二醇祖师

范彬，石晓峰*，李爽

（1.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州 730050； 2.甘肃中医学院，甘肃兰州 730000）

不同透皮促进剂对祖师麻体外透皮吸收的影响

范彬1，石晓峰1*，李爽2

（1.甘肃省医学科学研究院，甘肃兰州 730050； 2.甘肃中医学院，甘肃兰州 730000）

目的研究不同促渗剂对祖师麻体外透皮促渗作用的影响。方法采用 ZTY智能透皮试验仪，以离体雄性大鼠腹部皮肤为模型，通过高效液相色谱法测定接受液中祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的量，计算不同时段药物的累积渗透量和渗透速率。结果 4%冰片、 4%油酸、 5%氮酮、 1% ～5%丙二醇、 1 ∶1 ～1 ∶4 氮酮-丙二醇均能促进祖师麻有效成分的吸收，其中氮酮和丙二醇促渗效果明显；采用 4%氮酮时促渗效果最佳。结论可选择 4%氮酮作为祖师麻经皮给药制剂的最佳透皮吸收促进剂。

祖师麻；透皮促进剂；祖师麻甲素； 7-羟基香豆素；透皮吸收

祖师麻 Daphne Cortex为瑞香科植物黄瑞香 Daphne giraldii Nitsche、唐古特瑞香 Daphne tangutica Maxim及凹叶瑞香 Daphne retusa Hemsl的干燥根皮与茎皮［1］。始载于《陕西中草药》，辛、苦，温、有小毒；归肝经［2］。祖师麻的主要化学成分为香豆素类、二萜类、木脂素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等［3］，其主要有效成分为瑞香素（7，8-二羟基香豆素、又称祖师麻甲素， daphnetin）、瑞香苷（祖师麻乙素， daphnin）、紫丁香苷（ syringin）、伞形花内酯（7-羟基香豆素、 7-Hydrangine）等，以祖师麻甲素为代表的香豆素类成分具有明显的镇痛、抗炎、抑菌、抗血栓、抗凝血等药理作用［4］。本实验应用 ZTY智能透皮试验仪，以祖师麻甲素和 7-羟基香豆素作为测量指标，考察不同促进剂对祖师麻浸膏粉中香豆素类成分透皮吸收的影响，希冀为祖师麻经皮给药制剂的研究提供参考。

1 仪器、材料与动物

1.1 仪器 Agilent1120 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； ZTY智能透皮试验仪 TP2A （巩义市英峪予华仪器厂）； AE260 型万分之一电子天平（瑞士 Mettle Toledo公司）； SK3310HLC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药祖师麻浸膏粉（批号 20111118）由甘肃泰康制药有限责任公司提供；氮酮（化学纯，批号 20111010）由上海山浦化工有限公司提供；油酸（分析纯，批号20100912）由烟台市双双化工有限公司提供； 1，2 丙二醇（分析纯，批号 20100619）由天津博迪化工股份有限公司提供；聚乙二醇 400 （分析纯，批号 20110322）由天津市凯信化学工业有限公司提供；甲醇（色谱纯，批号20110627012）；乙腈（色谱纯，批号 2010100102）均由西陇化工股份公司提供；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，体质量 300 g～350 g，兰州大学实验动物中心提供，动物合格证号： SCXK （甘）2009-0004

2 方法与结果

2.1 大鼠离体皮肤的制备取 SD大鼠，腹部皮肤用脱毛剂 8%Na2S 溶液脱毛，清水洗净皮肤表面，饲养 24 h 后断颈处死，剪下腹部皮肤，剥离皮下脂肪及黏液组织，用蒸馏水反复洗净，再用生理盐水漂洗后，浸于生理盐水中，4℃冰箱短期保存，备用［5］。

2.2 体外透皮吸收试验测定采用 ZTY智能透皮试验仪，取制备好的鼠皮，剪成适当大小的 3 片（3.4 cm2），分别置于透皮试验仪的3个供给池与接受池之间，角质层面向供给池，真皮层面向接受池，使皮肤结合紧密勿有气泡。取0.500 0 g祖师麻浸膏粉与不同浓度的透皮促进剂混合均匀后，贴在鼠皮表皮，接受室内为 15 mL接受液（ PEG400∶95%EtOH∶生理盐水 =1 ∶3 ∶6）。开动恒温水浴循环（37 ±1）℃和磁力加热搅拌器（300 r/min），开始计时，随时排除接受池中气泡，在设定时间点 2、 4、 6、 8、10、 12、 24 h 分别从接受池取样 1 mL，并立即补充等体积37 ℃接受液。取出样品用 0.45 μm微孔滤膜过滤后，以高效液相色谱（HPLC）法测定各时间祖师麻甲素、 7-羟基香豆素的质量浓度，计算单位面积内的累积渗透量 Qn（μg· cm-2）。计算公式（1）如下：

2.3 样品测定

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取祖师麻甲素对照品

式中， A为渗透面积（3.4 cm-2）； V为接受室容积（15 mL）； Vi为每次取样体积（1 mL）； Cn为第 n 次取样时接收液中的药物质量浓度（μg/mL）； Ci为第 i次取样时接收液中的药物质量浓度（μg/mL）。

然后以时间 t（h）为横坐标，累积渗透量 Qn（μg·cm-2）为纵坐标，对曲线中的直线部分进行回归分析，所得方程即为 Qn-t方程，其斜率为透皮速率常数 J（μg·cm-2·h-1）。再以如下公式（2）计算促透剂的促透倍数（Enhancement Ratio， ER），其中 Jenhancers为加入促透剂后药物的稳态透皮速率， Jcontrol为未加促透剂时药物的稳态透皮速率［6-8］。 0.008 3 g，置 10mL量瓶中，加 40%乙醇溶解并定容至刻度，即得祖师麻甲素对照品贮备液。精密吸取上述贮备液2 mL于 5 mL量瓶中，加 40%乙醇定容至刻度，配制成每1mL含祖师麻甲素 0.332mg的对照品溶液。

精密称取 7-羟基香豆素对照品0.010 4 g，置 25 mL量瓶中，加 40%乙醇溶解并定容至刻度，即得 7-羟基香豆素对照品贮备液。精密吸取上述贮备液 1 mL于 10 mL量瓶中，加 40%乙醇定容至刻度，配制成每 1mL含 7-羟基香豆素 41.6 μg的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备按 “2.2” 项下操作在设定时间点取渗透接受液 1 mL，用 0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3 色谱条件与系统适用性试验［9-11］Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6mm×250mm， 5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（15 ∶85）；体积流量 1.0mL/min；检测波长 327 nm；柱温 30 ℃；进样量 20 μL。依上述色谱条件进样测定。结果样品中祖师麻甲素、 7-羟基香豆素均得到较好分离，与其相邻色谱峰分离度＞1.5。理论塔板数以祖师麻甲素峰面积计算不得低于3 000。结果见图 1。

图1 对照品和样品的高效液相色谱图

2.3.4 线性关系的考察分别精密吸取祖师麻甲素对照品溶液10、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000 μL至1 mL量瓶中，精密吸取 7-羟基香豆素对照品溶液 10、 100、 200、400、 600、 800 μL至 1 mL量瓶中，用 40%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述各对照品溶液 20 μL，依次进样测定峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归。得祖师麻甲素回归方程：Y=1.260 41 ×106X-2.004 76 ×106（r=0.999 9），线性范围 3.32 ～265.6 μg/mL。 7-羟基香豆素回归方程： Y= 1.392 06 ×106X+416 583 （r=0.999 6），线性范围0.416 ～33.28 μg/mL。结果表明：祖师麻甲素和 7-羟基香豆素在其质量浓度范围内与峰面积值呈良好线性关系。

2.4 透皮吸收促进剂的优选

2.4.1 不同透皮吸收促进剂的考察精密称取祖师麻浸膏粉0.500 0 g，分别加入 4%冰片（borneol）、 4%油酸（Oleic acid， OA）、 5%氮酮（ azone）、 1% ～5%丙二醇（1， 2-propyleneglycol， PG）、 1 ∶1 ～1 ∶4 氮酮-丙二醇（ azone-PG）混合均匀，按 “2.3.2” 项下制备样品，比较不同透皮促进剂对祖师麻甲素累计渗透量的影响。结果见表1。由表1可知， 12种透皮促进剂对祖师麻甲素均具有经皮促透效果，以 4%油酸、 5%氮酮、 4% 丙二醇和氮酮-丙二醇（1 ∶1）对祖师麻甲素的促透效果显著；比较24 h 累积渗透量， 5%氮酮和 4%丙二醇的明显大于其他促进剂； ER显示 5%氮酮大于4%丙二醇，故选用氮酮作为促进剂。

2.4.2 氮酮的最佳质量分数考察取祖师麻浸膏粉0.500 0 g，分别加入 1%、 2%、 3%、 4%、 5%氮酮混合均匀，比较不同质量分数氮酮对祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的累计渗透量的影响。结果见表 2、图 2。当氮酮的质量分数为 4%时，促渗效果最好，祖师麻甲素和 7-羟基香豆素24 h 累积渗透量分别为1 260.433 μg/cm和 174.500 μg/cm，ER分别为 4.880 和 4.05，尤以 7-羟基香豆素的透皮效果显著。故最终选用4%氮酮作为祖师麻的透皮促进剂。

表1 不同透皮促进剂对祖师麻甲素的经皮渗透的影响

表 2 不同质量分数氮酮对祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的经皮渗透的影响（n=3）

图 2 不同质量分数氮酮对祖师麻甲素（A）和 7-羟基香豆素（B）的体外透皮吸收曲线

3 讨论

3.1 透皮给药剂型使用安全、方便、毒副作用小、疗效确切，可有效避免肝脏首过效应。促进药物透皮吸收的方法有药剂学方法、化学方法和物理方法［12］；添加适宜的透皮吸收促进剂是迄今研究最多和最直接有效的经皮渗透促进方法［13-14］，故寻找促进药物经皮渗透的方法是开发透皮吸收制剂的关键。

3.2 实验中制备不含透皮促进剂样品时，加入 4%的接受液，即 PEG 400 ∶95%EtOH∶生理盐水 =1 ∶3 ∶6 与祖师麻浸膏粉混合均匀后制备样品。此外，实验中，尽量选用离体鼠皮腹部中间薄厚一致部位，以此减少实验误差；接受液液面与离体鼠皮充分接触，以防气泡产生；接受液温度保持（37 ±1）℃，以免影响透皮效果。通过考察不同转速对祖师麻的透皮吸收的影响，其差异性不显著，故将搅拌器转速固定为 300 r/min。

3.3 本实验通过对常见的几种透皮促进剂的透皮效果的比较，发现 4%油酸作为透皮促进剂时，其 24 h 累计渗透量为 673.305 μg·cm-2， ER值为 3.367，但 t1ag大于 0，表明采用4%油酸有时滞产生，不利于祖师麻浸膏粉的透皮吸收；选用4%丙二醇作为透皮促进剂时，其透皮速率常数J为 35.921 μg·cm-2·h-1， ER值为 3.747，均小于 5%氮酮的透皮速率常数和ER值；而氮酮和丙二醇两种促渗剂合用时，其透皮吸收效果略逊于单独使用氮酮的。

3.4 氮酮是目前公认的优良促透剂，对皮肤的毒性、刺激性都很低，其最佳促透质量分数为 0.1% ～5%，再提高并不能增强其效果，甚至产生降低作用［15］，故本实验选择的氮酮分数范围在 1% ～5%。结果表明，在促渗剂 4%氮酮的作用下，祖师麻浸膏粉中主要成分祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的透皮吸收速率和 24 h累计渗透量最大，故确定4%氮酮作为祖师麻经皮给药制剂的最佳透皮吸收促进剂。

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