黄晓冬, 吴雅清, 许瑞安, 刘 嘉, 俞 愉, 蔡建秀

(1. 泉州师范学院 分子生物与药物化学福建省高等学校重点实验室, 福建 泉州 362000；2. 华侨大学 分子药物教育部工程中心, 福建 泉州 362021)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase)是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于动植物、真菌及微生物体内[1]，是生物体合成黑色素的关键酶，具有独特的双重催化功能，能先后催化黑色素生成过程中的3个反应途径：单酚(L-酪氨酸)的羟基化、二酚(L-多巴)的氧化及二羟基吲哚(DHI)的脱氢[2]。它首先催化L-酪氨酸羟基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列的酶促和非酶促反应生成中间体DHI，后者最终形成黑色素[2-4]。在人体内，酪氨酸酶引起皮肤、眼和头发等的黑化，但其异常过量表达可导致人体雀斑、黄褐斑与老年斑等色素沉着[5]；植物源食品包含的酪氨酸酶会引发不利的酶促褐变，使其营养质量下降，并导致经济损失[6]；昆虫表皮的酪氨酸酶催化产生的黑色素可以保护其免受紫外线辐射，酪氨酸酶还与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关，并影响昆虫的免疫系统和生长[5,7]。因此，研发与应用酪氨酸酶抑制剂(tyrosinase inhibitors，TI)抑制酪氨酸酶活性，是防止果蔬褐变和色素沉着[8]、研制美白化妆品和生物源杀虫剂[9]的一种重要途径。

迄今，研究者发现了大量天然或合成的酪氨酸酶抑制剂[10]，但同时也发现一些酪氨酸酶抑制剂存在着黑色素细胞毒性与副作用[11]，比如氢醌的致敏作用[12]和曲酸的致癌作用[13]等。因此，许多学者致力于寻找和开发无毒、高效和特异性强的酪氨酸酶抑制剂。由于植物次生代谢产物种类多样且含量较丰富，并具有多种生物活性且相对较安全，成为酪氨酸酶抑制剂筛选的主要来源与热点。近年来的研究结果表明：植物来源的酪氨酸酶抑制剂涵盖糖苷类、黄酮及多酚类和醛类等多种化学成分，其中，植物多酚(plant ployphenols)广泛存在于植物体内，含量仅次于纤维素、半纤维素与木质素；其具有的1个或多个酚羟基能及时清除过氧自由基，进而可减弱酪氨酸的氧化作用，并且酚羟基还可能与酪氨酸酶分子中的Cu2+络合而抑制该酶活性[14]。因而，植物多酚被普遍认为是理想的且有开发前景的酪氨酸酶抑制剂之一。据报道，从蔷薇科(Rosaceae)李属(PrunusLinn.)植物青梅(P.mumeSieb. et Zucc.)花中提取的多酚提取物[15]、从蔷薇科苹果属(MalusMill.)植物苹果(M.pumilaMill.)中纯化的苹果多酚[5]和茶多酚(TPP)[16]、从柿树科(Ebenaceae)柿属(DiospyrosLinn.)植物柿树(D.kakiThunb.)中分离的多酚[17]、从桑科(Moraceae)桑属(MorusLinn.)植物鲁桑〔M.lhou(Ser.) Koidz.〕中分离的多酚[18]等均具有酪氨酸酶抑制活性。

桐花树〔Aegicerascorniculatum(Linn.) Blanco〕为紫金牛科(Myrsinaceae)蜡烛果属(AegicerasGaertn.)的红树植物，是红树林的广布种之一，生于海边滩涂上，为了适应海洋盐生环境该种体内富含单宁等多酚类化合物[19-20]。目前，对桐花树多酚作为酪氨酸酶抑制剂的研究尚未见报道。作者以自然分布于泉州湾河口湿地的桐花树叶片为实验材料，初步制备桐花树叶片多酚提取物，并研究该多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用，同时测定其对DPPH·自由基的清除能力及对化妆品中常见腐败菌的抑菌作用，以期为桐花树叶片多酚提取物的开发应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 多酚提取物获得和样液配制 供试桐花树叶片于2012年5月份采自福建泉州湾红树林湿地，洗净去杂后用水蒸气加热2～5 min，使样品中酚氧化酶PPO等丧失活性[20]；沥干并阴干后磨成粉末，过60目筛；为去除叶绿素并脱脂和脱蜡，置于索氏提取器中用石油醚(30 ℃～60 ℃)提取至浸出液无色为止；自然挥发去除石油醚后，密封遮光冷藏(-20 ℃)备用。取处理后的桐花树粉末按料液比(W∶V)1∶20的比例加入体积分数50%乙醇，于温度70 ℃条件下超声波(功率210 W、频率80 kHz)辅助提取70 min，抽滤后的滤液即为多酚提取液。将提取液减压浓缩(约50 ℃，-0.01 kPa)去醇至一定体积后， 按30 mL加 0.5 g的比例加入AlCl3，并用1 mol·L-1NaHCO3调节至pH 5.1～pH 6.0，静置待多酚沉淀，离心；沉淀用0.5 mol·L-1HCl转溶，再按照V∶V=1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，每次5 min；合并乙酸乙酯萃取液并减压蒸馏(40 ℃，-0.01 kPa)除去乙酸乙酯，残渣干燥后即得多酚提取物，避光保存于-20 ℃，备用。

使用时用DMSO配成质量浓度1.000 g·L-1母液，并稀释成质量浓度0.100～1.000 g·L-1的多酚提取物样液Ⅰ，供酪氨酸酶活性抑制测定与自由基清除能力测定；另将多酚提取物预先用体积分数95%乙醇助溶，以无菌水稀释配成2倍比浓度系列的样液Ⅱ(12.5～100 g·L-1)，对应溶媒乙醇的体积分数为4.75%～38.00%,供抗菌活性测定；取一定量的多酚提取物，用体积分数70%乙醇溶解并定容至50 mL，作为供测样液Ⅲ。

1.1.2 仪器和试剂 主要仪器：L5紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；PHB-4便携式酸度计(上海伟业仪器厂)；TGL-10B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ-300VDE台式双频数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

主要试剂：酪氨酸酶(1 680 U·mg-1，美国Worthington公司)，用50 mmol·L-1PBS配制成相应浓度；没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，纯度89.9%，批号110831-201204)；槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，纯度97.3%，批号100081-200406)；左旋多巴(L-DOPA)(美国Sigma公司)；防腐剂布罗波尔Bronopol(日用化工级，广州冠志化工有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠等均为国产分析纯。

1.1.3 供试菌种 供试菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)均由福建师范大学生物工程学院微生物教研组提供。

1.2 方法

1.2.1 多酚提取物中多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu法[21]测定多酚含量。取0.2 mL样液Ⅲ，加入1.0 mL蒸馏水和1.0 mL Folin酚试剂，漩涡振荡，暗处放置8 min后加入1.0 mL质量体积分数7.5%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25 mL，充分混合，室温静置120 min显色，于波长760 nm处测定吸光度值。按同法用没食子酸对照品作标准曲线，1 g提取物中的多酚含量以没食子酸当量(gallic acid equivalent，GAE)计。

1.2.2 多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的测定 酪氨酸酶活性测定参照石嘉怿[15]的方法并略加修改。在总体积3.0 mL的酶活反应测定体系中，依次加入多酚提取物样液Ⅰ 0.1 mL、200 U·mL-1酪氨酸酶溶液0.1 mL 和0.5 mmol·L-1L-DOPA底物溶液2.8 mL，充分混匀，37 ℃水浴保温10 min后，于波长475 nm处测得样液组吸光度值A3；以DMSO代替样液Ⅰ，测得空白对照组吸光度值A1；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替样液Ⅰ和酪氨酸酶溶液，测得空白对照组背景吸光度值A2；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替酪氨酸酶溶液，测得样液组背景吸光度值A4。提取物对酪氨酸酶活性的抑制率(I)按下式计算：I=〔1-(A3-A4)/(A1-A2)〕×100%。以槲皮素为阳性对照，实验重复3次。

在上述的酶活反应测定体系中，改变酪氨酸酶浓度([E]分别为25、50、100、150和200 U·mL-1)，分别测定质量浓度0.000、0.650和0.950 g·L-1的多酚提取物样液Ⅰ对不同浓度酪氨酸酶活性的影响，于波长475 nm处测定吸光度值，实验重复3次。酪氨酸酶催化反应速率v以酶活反应测定体系反应终止后测得的吸光度值A475定量表征[22]。A475的计算公式为A475=A3-A4，其中，A3和A4分别是样液组吸光度值和样液组背景吸光度值。以酪氨酸酶浓度[E]为X轴、以A475为Y轴作图，并依此判断多酚提取物样液对酪氨酸酶活性抑制作用的类型。

1.2.3 多酚提取物对酪氨酸酶活性抑制的动力学分析 上述酶活反应测定体系中，改变L-DOPA底物浓度([S]分别为0.200、0.250、0.333、0.500、1.000和2.000 mmol·L-1)，测定不同质量浓度([I]分别为0.000、0.350和0.650 g·L-1)多酚提取物样液Ⅰ对酪氨酸酶活性的影响，于波长475 nm处测定吸光度值，实验重复3次。按上法表征酪氨酸酶催化反应的速率v。采用Lineweaver-Burk双倒数法[23]79作图，通过米氏常数Km和酶促反应最大速率vm的变化来判断抑制类型。

1.2.4 多酚提取物对DPPH·自由基清除能力的测定 多酚提取物对DPPH·自由基清除能力的测定参照钟瑞敏等[24]的方法并略加修改。分别取200 μL各浓度测试样液Ⅰ，与0.06 mmol·L-1DPPH·甲醇溶液4 mL混匀，15 min后于波长517 nm处测得吸光度值AS；以200 μL甲醇代替样液测得空白对照组吸光度值A0；考虑样液本身的颜色，以甲醇代替DPPH·甲醇溶液测得样液本底吸光度值AB；自由基清除率(D)的计算公式为：D=[1-(AS-AB)/A0]×100%。以槲皮素为阳性对照，DPPH·自由基清除能力以自由基清除率D与等量槲皮素(quercetin equivalent，QE)表示，实验设3次重复。

1.2.5 多酚提取物抗菌活性的测定 采用管碟法[25]测定抑菌圈直径。用无菌移液枪分别吸取0.2 mL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌悬液(0.5×107CFU·mL-1)均匀涂布于平板(内径90 mm)表面，在每平板上等距离放入4只灭菌牛津杯(10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm)，并在每个牛津杯中加入样液Ⅱ 200 μL，以相应溶媒作空白对照；37 ℃恒温培养24 h后观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径，以抑菌圈直径(d)评价抑菌效果，计算公式为：d=样液抑制圈直径-空白对照抑制圈直径。实验重复3次并计算平均值。

参照文献[25]测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用无菌移液枪吸取1.0 mL样液Ⅱ，与15 mL无菌营养琼脂培养基(温度低于45 ℃)充分混匀，冷却后制成含样液平板，以相应溶媒作空白对照、Bronopol为阳性对照；吸取上述菌悬液0.1 mL均匀涂布于各平板上，37 ℃恒温倒置培养24 h后观察3种细菌的生长状况，以完全无细菌生长的最低样液浓度作为最低抑菌浓度。

1.3 数据统计分析

桐花树叶片醇提取物和多酚提取物得率的计算公式分别为：醇提取物得率=醇提取物质量/桐花树叶片粉末质量；多酚提取物得率=多酚提取物质量/桐花树叶片粉末质量。

采用EXCEL 2003和SPSS Statistics V17.0等软件进行数据处理与统计分析，采用EXCEL软件作图；实验数据均为3次重复的平均值，采用独立样本t检验进行组间均值方差分析。

2 结果和分析

2.1 桐花树叶片多酚提取物的得率与多酚含量

经超声波辅助提取，桐花树叶片醇提取物得率为(281.2±25.6) mg·g-1，醇提液经金属盐沉淀、盐酸转溶沉淀和乙酸乙酯萃取后获得多酚提取物，得率约为(122.0±31.4) mg·g-1，经Folin-Ciocalteu法测得该多酚提取物中多酚含量为(521.8±17.2) mg·g-1。

2.2 桐花树叶片多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用分析

2.2.1 多酚提取物对酪氨酸酶活性的影响 桐花树叶片多酚提取物和槲皮素对酪氨酸酶活性抑制率的量效关系见图1。由图1可见：多酚提取物和阳性对照槲皮素对酪氨酸酶活性的抑制率均随其质量浓度的提高而增大，呈明显正相关的量效关系(R2分别为0.957 1和0.930 4)。质量浓度0.950 g·L-1多酚提取物和槲皮素对酪氨酸酶活性的抑制率分别高达73.36%和82.17%，但二者差异不显著(P>0.05)。根据二者的线性回归方程获得多酚提取物与槲皮素对酪氨酸酶活性的半抑制浓度(IC50)分别为0.650和0.600 g·L-1，提示桐花树叶片多酚提取物和槲皮素对酪氨酸酶活性的抑制能力相近。

●: 多酚提取物Polyphenol extracts; ○: 槲皮素Quercetin.

2.2.2 多酚提取物对不同浓度酪氨酸酶活性的抑制作用 实验结果显示(图2)：在底物浓度和桐花树叶片多酚提取物质量浓度不变的条件下，随着酪氨酸酶浓度的提高，反应体系的吸光度值A475呈线性增加；而在底物浓度和酪氨酸酶浓度不变的情况下，A475随多酚提取物质量浓度的提高而下降。以A475对酪氨酸酶浓度[E]作图可得3条通过原点的直线(图2)，直线斜率随提取物质量浓度增加而下降，说明桐花树叶片多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用不是通过降低有效酶量而是通过降低酶活性实现的，表现为可逆性抑制作用。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts;

2.2.3 多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制动力学由Lineweaver-Burk方程(表1)可见：随提取物质量浓度的提高,米氏常数Km值增大、酶促反应最大速率vm值减小，这与混合Ⅰ型抑制类型的动力学特征相符，即桐花树叶片多酚提取物既可以与游离酶(E)结合，也可以与酶-底物络合物(ES)在非活性中心结合，导致酪氨酸酶活性降低。以1/v对1/[S]进行Lineweaver-Burk双倒数作图，得到1组相交于第二象限的直线(图3-a)。进一步以Lineweaver-Burk双倒数图的斜率与截距对相应的多酚提取物浓度二次作图均呈直线(见图3-b，c)。计算结果显示：桐花树叶片多酚提取物对游离酪氨酸酶活性的抑制常数Ki为0.833 g·L-1、对酶-底物络合物的抑制常数Kis为1.823 g·L-1，Kis为Ki的2.19倍，说明桐花树叶片多酚提取物与游离酶的亲和力大于其与酶-底物络合物的亲和力。

表1 不同浓度桐花树叶片多酚提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的动力学参数1)

2.3 桐花树叶片多酚提取物对DPPH·自由基的清除能力

自由基能上调酪氨酸酶mRNA的表达，抗氧化作用是酪氨酸酶抑制机制之一[26]。DPPH·自由基反应体系由于具有简便、快速、重复性好等特点而广泛应用于自由基清除剂的筛选及纯抗氧化剂或植物提取物的体外抗氧化活性测定[27]。不同浓度桐花树叶片多酚提取物对DPPH·自由基的清除作用见表2。由表2可知：桐花树叶片多酚提取物对DPPH·自由基表现出较强的清除能力，清除率随提取物质量浓度的提高而增大。在质量浓度0.000～0.600 g·L-1范围内提取物与DPPH·自由基清除率有明显的量效关系，线性回归方程为：y=106.45x+17.638(R2=0.971 0，P<0.01)。以此计算出桐花树叶片多酚提取物对DPPH·自由基的半抑制浓度IC50为0.304 g·L-1，与0.036 g·L-1槲皮素等效。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts; ●: 0.350 g·L-1多酚提取物 0.350 g·L-1 polyphenol extracts; ▲: 0.650 g·L-1多酚提取物 0.650 g·L-1 polyphenol extracts. [S]: L-DOPA浓度Concentration of L-DOPA (mmol·L-1); v: 用波长475 nm处的吸光度值A475表征 Represented by absorbance value A475 in wavelength 475 nm; [I]: 多酚提取物浓度Concentration of polyphenol extracts (g·L-1).

表2 不同浓度桐花树叶片多酚提取物对DPPH·自由基的清除作用

2.4 桐花树叶片多酚提取物的抑菌活性

不同浓度桐花树叶片多酚提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径见表3。由表3可知：多酚提取物对3种供试菌的抑菌圈直径均随提取物质量浓度的提高而增大，50 g·L-1多酚提取物对3种供试菌均表现出抑菌作用，质量浓度为100 g·L-1时，多酚提取物对3种供试菌的抑菌圈直径均达15 mm以上，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达20 mm以上。最小抑菌浓度(MIC)测定结果进一步显示：桐花树叶片多酚提取物对供试3种细菌的MIC均为25 g·L-1，相当于化妆品防腐剂Bronopol对供试3种细菌的MIC(对大肠杆菌的MIC小于或等于2 g·L-1，对金黄色葡萄球菌的MIC为4 g·L-1，对枯草芽孢杆菌的MIC为4 g·L-1)。

表3 不同浓度桐花树叶片多酚提取物的抑菌圈直径比较

3 讨 论

人体皮肤黑化、色素沉着性疾病及黑色素瘤的发生与黑色素合成最关键的限速酶——酪氨酸酶的催化活力升高和过量表达有关。酪氨酸酶抑制剂(TI)可以通过抑制酪氨酸酶的活性来预防和治疗色素沉着并使皮肤美白。为了筛选TI并探明其作用机制，研究者常采用体外化学模型体系的酪氨酸酶活性抑制实验、动力学分析[26]以及基于细胞培养的酪氨酸酶活性检测技术[28]。从天然植物组织中分离提取、从商品化合物中筛选和有机合成新化合物是目前寻找TI的3个主要路径[5]，其中植物源TI因具有高效、无毒的特点而备受青睐，并已广泛应用于增白美容化妆品中。植物多酚就是美白化妆品TI的理想选项之一，其吸收紫外线、抗氧化与清除自由基以及对酪氨酸酶活性抑制能力强等特点使之具有与众不同的美白综合效应[29]。

红树植物是一类常年生长于盐生环境中的特殊植物，较高含量的多酚(单宁)是一些红树植物提高抗腐蚀性以适应盐生环境的生存策略之一[19]。柴纬明等[30]从红树植物秋茄树〔Kandeliacandel(Linn.) Druce〕叶片中获得缩合单宁，并发现它对蘑菇酪氨酸酶具有很强的抑制作用，IC50仅为30.0 μg·mL-1，这一研究结果显示出红树植物中的多酚类物质作为TI开发的可能性与独特性。同为红树植物的桐花树，叶片解剖结构及成分分析的研究结果均显示其体内含有较高水平的多酚[19,31]。鉴于此，作者选用金属盐沉淀-乙酸乙酯萃取相结合的方法获得桐花树叶片多酚提取物，其叶片多酚提取物的多酚含量约为521.8 mg·g-1；根据酚类分子量与乙酸乙酯溶剂的关系，初步判断经乙酸乙酯萃取获得的多酚可能主要为中等分子量的多酚类成分[32]，相比于大分子量多酚的强收敛性所产生的皮肤刺激副作用，桐花树叶片多酚提取物更适合作为化妆品添加剂。

为了探明桐花树叶片多酚提取物的酪氨酸酶活性抑制能力，作者选用相对简单、便捷的体外化学模型体系进行酪氨酸酶抑制活性检测，由于桐花树叶片多酚提取物在水溶液中的溶解度相对较小，一般的有机溶剂(如乙醇等)对酪氨酸酶又具有一定的抑制作用[33]25，故而选用DMSO作为溶媒。邱凌[33]25认为DMSO-H2O体系不会对酪氨酸酶活性产生抑制作用；但陈懿等[34]研究了DMSO对酪氨酸酶活性的影响，认为DMSO体积分数大于25%时酪氨酸酶活性会急剧下降；而更多的研究者通常将反应体系中DMSO的用量控制为体积分数3.33%[26],[33]26，以尽量避免DMSO的影响并保证实验效果。因此，在本研究中作者也将反应体系中DMSO的用量设定为体积分数3.33%。研究结果表明：桐花树叶片多酚提取物具有明显的酪氨酸酶活性抑制作用，IC50为0.650 g·L-1，其酪氨酸酶活性抑制能力与槲皮素(IC50为0.600 g·L-1)相近，而在黄酮类化合物中槲皮素是对酪氨酸酶活性抑制率较高的可逆抑制剂[35]。由此可见，桐花树叶片多酚提取物是一种潜在的、有效的酪氨酸酶活性抑制剂，可通过柱色谱分离技术和活性追踪方法进一步筛选出该多酚提取物中高效的TI组分或单体成分。

根据抑制剂与酶作用的特点，酶抑制类型可分为可逆抑制和不可逆抑制2类，前者又可分为竞争性抑制、反竞争性抑制、非竞争性抑制和混合型抑制等4种类型。李航等[14]认为：对酪氨酸酶活性的可逆抑制类型中还应包括一种缓慢结合型抑制，即抑制剂与酶快速形成EI复合物后缓慢的可逆异构化。在判定酶抑制类型时，Lineweaver-Burk双倒数作图分析是一种常用的有效方法，作图后如果得到一组相交于Y轴的直线则为竞争性抑制，如果得到一组相交于X轴的直线则为非竞争性抑制，如果得到一组平行的直线则为反竞争性抑制，如果得到一组相交于第二或第四象限的直线则为混合Ⅰ型(兼具竞争性与非竞争性抑制)或混合Ⅱ型抑制(兼具反竞争性与非竞争性抑制)[36]。在这些抑制类型中，混合型抑制较为常见[23]120。本研究结果表明：桐花树叶片多酚提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数作图所得直线相交于第二象限，动力学参数表现为随提取物质量浓度提高Km值增大、vm值减小，抑制类型属于可逆的混合Ⅰ型抑制，其实现对酶活性的抑制一方面是通过与底物的竞争，另一方面是通过与酶-底物络合物(ES)的亲和，这种抑制作用兼具竞争性和非竞争性抑制的特点。进一步的分析结果显示：桐花树叶片多酚提取物对游离酶活性的抑制常数Ki(0.833 g·L-1)小于该多酚提取物对酶-底物络合物的抑制常数Kis(1.823 g·L-1)，说明该多酚提取物对游离酶活性的抑制作用强于其对酶-底物络合物的抑制作用。这些特征与秋茄树叶片中的缩合单宁[30]、青梅花提取物[15]和叶下珠(PhyllanthusurinariaLinn.)提取物[26]对酪氨酸酶活性的抑制类型相似。

有关酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶活性抑制的机制主要包括3个方面：结构与酶底物相似；络合酪氨酸酶的Cu2+；清除活性氧并拮抗氧对酪氨酸酶的激活[37]。根据桐花树叶片多酚提取物具有酚羟基的结构特点及其对酪氨酸酶活性抑制作用的混合Ⅰ型抑制作用特征，初步判断其对酪氨酸酶活性的抑制具有多维机制。一方面，该提取物含有与L-DOPA分子结构相似的多羟基化学成分[30]，可以被酪氨酸酶催化[15]并作为竞争性底物与酪氨酸酶结合，削弱酪氨酸酶的催化氧化作用[9]；酚羟基的孤对电子可与酪氨酸酶分子中的Cu2+络合而抑制酶活性，酚羟基还可与酶-底物络合物的非活性中心结合并可能对酶活性中心双核铜间的内源桥基产生影响[14]，体现出该提取物混合Ⅰ型抑制剂的特点。另一方面，酪氨酸酶是一种含铜需氧酶，其催化功能必须在氧自由基参与下才能完成，通过清除氧自由基可以减弱或阻断酪氨酸酶的催化反应[33]6,157；桐花树叶片多酚提取物清除DPPH·自由基的IC50为0.304 g·L-1，表明其具有较强的抗氧化与清除自由基能力，清除氧自由基、终止自由基链的引发以及拮抗氧对酪氨酸酶的激活也是桐花树叶片多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的一个重要机制。除了抑制酪氨酸酶活性，桐花树叶片多酚提取物是否可以通过下调酪氨酸酶mRNA表达来降低酪氨酸酶水平？以及是否影响酪氨酸酶表达的信号通路？这些疑问均有待综合运用细胞培养、RT-PCR和Western Blot等实验手段加以揭示与探明。

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌是引起化妆品变质、腐败以及色泽和气味变化的常见腐败菌。防止化妆品腐败变质的简单有效方法是向化妆品中加入防腐剂，但是合成防腐剂往往具有一定的皮肤毒性且易诱发过敏反应[38]，因而，人们倾向于以植物源防腐剂代替化学合成防腐剂。本实验结果表明：桐花树叶片多酚提取物对3种常见的化妆品腐败菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)均有抑菌作用，其抑菌强度随提取物浓度提高而增加；其中，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较为突出，100 g·L-1提取物的抑菌圈直径达20 mm以上。从MIC来看，桐花树叶片多酚提取物对供试3种细菌的MIC均为25 g·L-1，大于化妆品防腐剂Bronopol的MIC。由于国家对化妆品防腐剂的使用量有严格规定，《化妆品卫生规范》(2007版)规定Bronopol最大允许使用浓度为质量分数0.1%[39]，均低于Bronopol对3种供试菌的MIC，对化妆品的防腐性有一定影响。因此，将具有抑菌活性的桐花树叶片多酚提取物用于化妆品中，既可以提升化妆品的防腐性，也可降低Bronopol等化学合成防腐剂的使用量与副作用。研究结果显示：桐花树叶片多酚提取物可作为具有辅助防腐抑菌功能的新型酪氨酸酶抑制剂应用于美白化妆品的研制。

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