何静林

（杭州市萧山区环境监测站，浙江 杭州，311200）

我国是一个农业大国，同时也是农药生产和使用大国，农药在保障农作物产量方面具有不可忽视的作用，但长期大量使用农药将造成微量或痕量的农药残留在粮食、蔬菜中，极易对人类、动物、环境等产生急慢性毒害，严重威胁到人类的生存环境和身体健康，因此对农药残留进行快速、及时、准确、灵敏的实时监控和检测，成为迫切解决的农药污染问题。对于农药的定性和定量检测主要有色谱法、质谱法和光谱分析法等，但这些技术由于耗时长、费用昂贵，并且只能由专业人员操作，体积较大，携带不太方便，不适合现场或野外使用。由于农药的大量使用，涉及面较广，急需建立和发展一些便捷、快速检测方法。生物传感技术因选择性高、灵敏度高、稳定性好、成本低以及能在复杂体系中实现连续快速监测而受到众多研究者的关注。

1 生物传感技术的原理及分类

生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合，从而检测目标物的分析装置，利用固定化的生物活性物质，如酶、抗原、微生物、抗体、细胞、组织、核酸等作为传感器的识别元件，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等）及信号放大装置将这些反应（形成复合物、发色、发光等）转换成可以输出检测的信号（电压、频率等），通过分析信号对待测物进行定性和定量检测。

按照生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶生物传感器，微生物传感器，细胞传感器，组织传感器和免疫传感器。显而易见，所应用的敏感材料依次为酶、微生物个体、细胞器、动植物组织、抗原和抗体。

按照生物传感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极传感器，半导体生物传感器，光生物传感器，热生物传感器，压电晶体生物传感器等，换能器依次为电化学电极、半导体、光电转换器、热敏电阻、压电晶体等。

以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类有生物亲和型生物传感器、代谢型或催化型生物传感器。三种分类方法之间实际互相交叉使用［1］。

2 生物传感技术在农药污染监测中的应用

2.1 酶生物传感器

酶生物传感器是通过测定固定在电极表面的酶的活性被农药抑制的程度，来推算分析样品中的农药残留量。酶生物传感器自发现以来，因选择性高、结构简单、自动、价廉而受到广泛应用。特别是微电子技术、纳米材料制备技术、生物技术的发展为扩展生物传感器的应用范围、批量生产、集成化、微型化打下了坚实的基础，极大地促进了酶生物传感器的研究与应用。酶生物传感器的最关键的部分就是酶的固定化。Albareda－Sirvent等［2］用戊二醛交联法将乙酰胆碱酯酶固定在铜丝碳糊电极表面，所构成的传感器可检测10mol／L的对氧磷和10－11 mol／L的克百威，检测加标的自来水和果汁，回收率接近100%，可用于直接测定这两类样品中两种农药的残留。丁家旺等［3］基于酶的生物传感器已经广泛用于农药的检测，尤其是以乙酰胆碱酯酶（AChE）的催化活性为基础的抑制型酶电极已大量应用于氨基甲酸酯和有机磷类农药的检测。基于电沉积构建了三种生物界面，壳聚糖，金纳米－壳聚糖复合膜，金纳米－自组装膜。在这些生物兼容膜上固定乙酰胆碱酯酶，用于农药的检测，检出限可达ng／mL级。另一方面，利用乙酰胆碱酯酶催化底物氯化乙酰硫代胆碱，产生的硫代胆碱的特性进行农药检测。李宏坤等［4］利用纳米粒子的特殊性质，建立了AChE纳米生物传感器法检测蔬菜中的OPs，方法快速、简便、灵敏，该传感器对久效磷进行检测的线性响应范围为0.5～12.0μg／mL，检出限为0.02μg／mL。传感器具有良好的重现性和稳定性，为OPs的检测提供了一种简便易行的方法。高慧丽等［5］采用溶胶－凝胶法将乙酰胆碱酯酶固定在醋酸纤维膜上，再将酶膜固定在聚四氨基钴酞菁（p－CoTAPc）修饰的玻碳电极（GCE）上，制备了可应用于有机磷农药测定的生物传感器，采用计时安培法对有机磷农药（对硫磷、辛硫磷、氧化乐果）进行检测。闵红等［6］研究了Au－Fe3O4纳米粒子酶传感器的制备及其在有机磷农药检测方面的应用合成了金掺杂的四氧化三铁纳米粒子（Au－Fe3O4），以壳聚糖为交联剂，制备了电流型乙酰胆碱酯酶（AChE）生物传感器，并将其应用于有机磷农药（OPs）的检测。实验表明，Au－Fe3O4纳米粒子具有良好的生物兼容性，能够有效地促进电极表面电化学反应的电子传递，Au－Fe3O4纳米粒子修饰的酶传感器，具有响应速度快、检测灵敏度高、稳定性好等优点；固定在传感器上的乙酰胆碱酯酶有良好的酶动力学响应。刘萍等［7］首次以甲基纤维素为载体，制备了一种基于抑制乙酰胆碱酯酶的电位型生物传感器。以甲胺磷、甲拌磷、对硫磷、毒死蜱和乐果等5种有机磷农药为检测对象，获得了上述5种有机磷农药的抑制时间，其结果分别为5、9、7、3和7min。杨丽娟等［8］自行设计加工一次性丝网印刷电极，并通过超声清洗、电化学氧化等处理，使普通油墨批量生产的电极取得了良好电化学响应特性，为后续试验提供基础；同时以玻碳电极为信号转换器，将乙酰胆碱酯酶通过多壁碳纳米管－戊二醛交联固定在电极表面，构建了用于农药残留检测的电流型生物传感器。

从这些研究同时可以看出目前大部分工作限于以胆碱酯酶作生物活性材料，许多有机磷农药对酶有同样的抑制作用，仅只能测出一类农药的总量。刘涛［9］等以石墨烯－纳米铂复合物修饰玻碳电极，并在纳米铂表面自组装一层巯基乙胺，通过静电作用固定酪氨酸酶，制备了一种新型酪氨酸酶生物传感器，基于酶抑制原理，采用计时电流技术对毒死蜱、丙溴磷和马拉硫磷等有机磷农药进行了电化学检测。

酶生物传感器主要存在酶活性不稳定和酶失活的问题，由于农药（有机磷）对酶的抑制是不可逆的，酶电极难以重复使用，且成本高。对于酶的抑制和可再生机制的研究一直是生物化学和生物技术领域的一个重要方面，特别是在固定化酶的应用上，酶的可再生机制显得尤为重要。

2.2 免疫传感器

免疫传感器是利用抗体和抗原之间的免疫化学反应来制作的生物传感器，免疫传感器分为竞争法和夹心法两类，按照所使用的信号转换器，有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器及表面等离子体共振（SPR）型传感器，能够高灵敏度、高选择性、方便、快速地检测待测样品中的农药残留量。Anis等研制开发的光纤免疫生物传感器用于测定样品中的对硫磷与色谱法相比，该法简便快速，分析周期缩短4／5［10］。蒋雪松等［11］探索了电化学阻抗谱用于农药残留检测的可行性，在电极修饰、抗体固定及对农药抗原的识别过程中，电化学阻抗谱能很好地与等效电路模型相吻合。研究了压电免疫传感器结合流动注射系统用于对硫磷农药残留的检测。结果显示，农药浓度在0.1－50μg／mL范围内，直接法压电免疫传感器的频率变化与浓度之间成良好的相关关系。建立了一种基于毛细管的光学免疫传感器，将抗原－抗体反应与生物素亲和素体系相结合用于三唑磷农药的检测。将间接免疫竞争法用于光学免疫传感器中，辣根过氧化物酶（HRP）酶标物催化四甲基联苯胺（TMB）底物，在655nm下测得产物吸光度，待测农药的浓度与吸光度成反比。Zhao等用多克隆抗体PCB抗体（Abs）制作敏感膜光纤免疫传感器对其测定，下限为10mg／L，时间仅几十秒到几分钟。黄君冉等［12］研究了基于自组装膜的直接型压电免疫传感器用于三唑磷农药残留的检测，采用1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基）－碳化二亚胺（EDC）和N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）对2－巯基苯甲酸（MBA）单分子层修饰的石英晶体电极表面进行活化，将三唑磷单克隆抗体共价结合到电极表面，建立了一种用于快速检测三唑磷农药的压电免疫生物传感器。杜淑媛等［13］运用自组装、溶胶－凝胶、电沉积、共价键合等技术构建了检测克百威农药残留的电化学免疫传感器，并引入纳米金、多壁碳、壳聚糖、蛋白A等新型纳米材料和电介质材料以提高免疫传感器的检测性能。

2.3 微生物传感器

酶对底物有高度专一性，但价格昂贵、稳定性差，因而许多生物传感器中用全活细胞，如细菌、酵母和真菌等，用其制成的传感器称为微生物传感器，一类是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用；另一类是利用不同微生物含有不同的酶，把它作为酶源。例如：细胞表面表达OPH的E.coli或对硝基酚（PNP）降解微生物传感器以及基于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的微生物传感器。细胞表面表达OPH的E.coli细胞与电势传感器（PH电极）相结合组成的微生物传感器，利用低熔点琼脂糖包埋E.coli，然后将其固定于处理过的尼龙膜上制成生物传感器，能快速检测低至2μmol／L的对氧磷、甲基对硫磷和二嗪农，相对胞内表达OPH的电势测定的微生物传感器，这类传感器提高了稳定性［14］。

Mulchan－dani等［15］将携带有机磷水解酶（OPH）基因片断的质粒转入一种摩拉氏菌的菌体内，筛选得到可在胞外表达OPH的改良菌，将适量的菌体与3：1的石墨粉和矿物油混合在一起制成工作电极的敏感元件。此传感器对甲基对硫磷和对氧磷的检测限可低达l×10－6mol／L和2×10－7mol／L。严珍等［16］在蔬菜残留农药传感器研制中，通过优化传感膜配方确定了以琼脂－牛奶作为主要原料的制备传感膜的工艺流程，成功地将发光菌包埋在滤纸膜中。在探头研制过程中，取消了光纤的使用，以微型光电倍增管直接连接在发光腔体上，提高了灵敏度，又实现了整体仪器的微型化的目的。所制备的两种发光菌配套仪器，都可成功的应用于实际监测。

2.4 仿生生物传感器

仿生生物传感器就是研究能代替生物视觉、嗅觉、味觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器，也称为以生物系统为模型的生物传感器。近年来，仿生生物传感器利用分子印迹聚合物（MIP）和双层脂膜（BLM）进行制作，后者是结构与生物膜相似的人工膜，具有良好的生物相容性，是构建生物传感器的理想敏感膜。Nikolelis等的研究显示，BLM传感器在分别接触久效磷3min、克百威5min后出现电流信号，信号强度随农药浓度的增加而增大，检测限分别为45nmol／L 和480nmol／L。MIP和BLM生物传感器是新型生物传感器的发展方向，目前这方面的研究还处于起步阶段，还有待进一步研究［17］。

3 结语及展望

农药的大量使用造成粮食、蔬菜等农药残留量超标，严重影响到人类的身体健康，传统的质谱色谱等仪器分析法，费用昂贵、耗时长、不易操作及难以携带等问题难以满足农药实时快速监测的需要。相比之下，生物传感器具有检测样品不需要预处理、固定化的敏感物质可重复使用、分析操作简单、响应快、成本低以及可自动化测量等特点，能够解决农药检测技术面临的难题，但仍存在着稳定性、选择性、精确度和寿命等问题，酶的筛选、酶的固定化以及酶的可再生机制研究是一个难点，为缩短响应时间和延长寿命将基膜做得尽可能薄是另一个难点。依托细胞化学、发酵化学、免疫化学和多肽排列结构等多方面学科知识，与现代生物技术（包括生物酶抑制技术、ELISA、HPLC、PCR、芯片技术等）相联合，向便携式、小型化、低成本、高灵敏度和高选择性的生物传感器发展是未来的趋势。

［1］乌日娜，李建科.生物传感器在农药残留分析中的研究现状及展望［J］.食品与机械，2005，21（2）：54－56.

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［3］丁家旺.电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的研制及农药残留分析［D］.武汉：华中师范大学硕士学位论文，2008（10）.

［4］李宏坤.乙酰胆碱酯酶纳米生物传感器法检测蔬菜中有机磷农药的研究［J］.吉林大学学报，2013，20（3）：64－70.

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［7］刘萍.有机磷农药快速检测技术及其应用研究［D］.重庆：西南大学硕士学位论文，2006（08）.

［8］杨丽娟，郑文刚，赵春江，等.用于农药残留检测的酶生物传感器［J］.工程科技，2009（03）：18－24.

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［10］邢少环，刘洁生.免疫传感器在食品污染检测中的应用［J］.食品科学，1999（8）：6－8.

［11］蒋雪松.用于有机磷农药残留检测的免疫生物传感器的研究［D］.浙江：浙江大学博士学位论文，2008（08）.

［12］黄君冉.用于农药残留检测的压电免疫生物传感器的研究［D］.浙江：浙江大学博士学位论文，2010（10）.

［13］杜淑媛.克百威农药残留检测用无标记电流型免疫传感器的制备方法研究［D］.山东：山东理工大学硕士学位论文，2012（10）.

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［16］严珍.发光菌生物传感器在海洋水质监测及蔬菜残留农药检测中的应用［D］.福建：厦门大学硕士学位论文，2002（02）.

［17］谢桂勉.有机磷农药多残留检测方法的研究进展［J］.广州化工，2011（6）：31－33.