王金水，周 阳，蔺丹华

（河南工业大学 1.生物工程学院；2.粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

花生属于八大类食物过敏原之一，影响人群广泛.美国有1.4%的儿童对花生过敏；加拿大超过1%的儿童对花生过敏；新加坡14～16 岁本地学生中，有0.47%的人对花生过敏[1-3].花生过敏不但影响人群数量多，而且对患者有很大的伤害性，可引发致死反应，美国每年100～200 人死于花生过敏.花生过敏一般伴随终身，且不能通过采取食物回避措施完全避免[4].因此解决花生过敏问题有着重要的意义.

现在被国际免疫学会（IUIS）下属的致敏原命名分会认可的花生过敏原共有13 种（Ara h 1 到Ara h 13）[5].虽然现在还没有解决这一问题的可行手段，但是已出现了很多很有希望的方法.医疗上的方法有口服免疫脱敏.

降低致敏性的方法有：传统育种、辐照育种、基因工程、高压蒸汽法、辐照法、鞣酸法，磁性球抓取法、酶处理法、发酵法等[6-9].在这些方法中，发酵具有温和、自然、一般不产生有害物的特点.相比基因工程、辐照等方法，发酵法不存在食品安全方面的担忧；相比高压蒸汽法、酶处理法，发酵更为廉价；相比鞣酸法等方法，发酵一般不会降低产品的营养价值，反而很可能增加产品的营养并带来怡人的风味.因此，发酵法是降低花生制品致敏性的一种非常有希望的方法.

作者尝试用一种益生菌（枯草芽孢杆菌）对低温压榨花生粕进行发酵，探索其发酵降低花生蛋白致敏性的效果及规律.

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌：河南工业大学9431 实验室保藏.

冷榨花生蛋白粉：德州宏鑫花生蛋白食品有限公司.

平板分离培养基：营养琼脂培养基；种子培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基；发酵培养基：10 g冷榨花生蛋白粉，150 mL 蒸馏水，0.75 g NaCl，搅拌均匀后121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min.

1.2 主要仪器

KDN-08C 凯氏定氮仪：上海新嘉电子有限公司；THZ-300 恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；V-GES 垂直凝胶电泳系统：Wealtec Corp；HP Scanjet G4010 扫描仪：惠普研发有限合伙公司.

1.3 发酵工艺

将保存的菌种在平面培养基上传代培养2 次（均培养21 h 至对数期）；选取生长旺盛的单菌落在种子培养基中，30 ℃、160 r/min 下扩大培养9 h至对数期；将制成的种子液按5%的接种量接种到发酵培养基中，在30 ℃、160 r/min 下分别发酵8、16、24、32、36、40、44、48、50、52 h.发酵后 的样 品立即冷冻干燥以作日后分析.

1.4 测定方法

1.4.1 总蛋白含量测定

参照GB/T 5009.5—2010 凯氏定氮法.

1.4.2 水溶性蛋白含量测定

称取5 g 样品，加入75 mL 蒸馏水，搅拌30 min，2 000 r/min 下离心20 min，取上清液，根据GB/T 5009.5—2010 进行原料的水溶性蛋白含量测定，另加入0.25 g NaCl.

1.4.3 pH 值测定

（1）发酵样品pH 测定：混匀后，倒取约50 mL 发酵液，测定pH 值.

（2）原料pH 测定：称取5 g 原料，加入75 mL蒸馏水、0.25 g NaCl，混匀后，测定pH 值.

1.4.4 水解度的测定

甲醛滴定法测定氨基氮含量：发酵样品以2 000 r/min 离心20 min，取上清液5 mL，加入60 mL 蒸馏水，用0.1 moL/L 标准NaOH 溶液滴定至pH 8.2，再加入20 mL pH 8.2 的中性甲醛溶液，继续用0.05 moL/L 标准NaOH 溶液滴定至pH 9.2，记录加入甲醛后消耗的标准NaOH 溶液体积，同时作空白对照.

式中：V1为样品消耗标准NaOH 溶液的体积，mL；V2为空白消耗标准NaOH 溶液的体积，mL；c1为标准NaOH 的浓度，mol/L；c2为样品的总蛋白浓度，g/mL；htot为1 g 花生蛋白所含的肽键总数7.13 mmol/g.

1.4.5 过敏原含量分析

4%浓缩胶，15%分离胶，胶板尺寸9 cm×9 cm；混合样品与样品缓冲液（包含甘油、SDS、β-巯基乙醇的Tris 缓冲液，pH 6.8），每个混合后的溶液蛋白浓度达到1.26 mg/mL，沸水浴处理10 min.冷却至室温，用处理后的样品溶液5 μL 上样（每个样品含蛋白6.3 μg）；用纯化的花生过敏原Ara h 1 和Ara h 2 做参照；垂直电泳：Tris-甘氨酸缓冲系统，145 V，30 mA，60 min；考马斯亮蓝R-250 染色4 h，脱色后用HP Scanjet G4010 扫描仪扫描成像.

1.4.6 感官评价

选取20 名嗅觉正常的人员，对原料及发酵样品进行颜色和气味的感官描述并给出感官评分（满分10 分）.排除异常分数后，对其余分数求平均值，作为某一发酵样品的感官得分.

2 结果与分析

2.1 发酵对样品基本理化指标和代谢的影响

发酵时间对样品总蛋白含量和水溶性蛋白含量的影响如图1 所示.

由图1 可以看出，高压蒸汽灭菌处理对样品的总蛋白含量没有影响，但是随着发酵时间的进行，样品总蛋白含量呈线性上升，但总体增幅很小（发酵52 h，样品总蛋白含量为32.85 mg/mL，相比原料增加了16%）.根据物质守恒原理，样品总蛋白含量的上升不可能是微生物本身的繁殖造成的，应该是由发酵过程中的水分遗失引起的.综合微生物发酵的一般规律和试验结果，枯草芽孢杆菌发酵对原料的总蛋白含量影响不大.

高压蒸汽灭菌处理稍微增加了样品的水溶性蛋白含量（增加量12.5%），而发酵显著持续地增加了样品的水溶性蛋白含量.发酵8 h，样品水溶性蛋白含量为10.89 mg/mL，为原料的1.57 倍；随着发酵的进行，其含量持续增加，发酵52 h，达到15.14 mg/mL，为原料的2.57 倍；水溶性蛋白增加的速度远远超过了水分遗失的速度.所以枯草芽孢杆菌发酵可以显著增加样品的水溶性蛋白含量.

发酵时间对样品水解度和pH 值的影响如图2所示.

由图2 可以看出，高压灭菌处理对样品的水解度没有影响；然而随着发酵时间的增加，样品的水解度越来越高.原料的水解度只有3.0%，而发酵44 h 时水解度可以达到13.4%，这表明枯草芽孢杆菌发酵可以显著增加样品的水解度.纵观整条曲线，水解度的变化经历了3 个阶段：0～16 h，水解度几乎保持不变；16～44 h，水解度呈指数快速增加；44～52 h，水解度趋于稳定.这一现象可能是由微生物的生长特性导致的.0～16 h，菌种处于生长的延滞期，代谢相对对数期较弱，对样品的水解度影响很小；16～44 h，菌种处于生长的对数期，代谢旺盛，水解度快速增加；44～52 h，菌种处于生长的稳定期或衰亡期，代谢能力下降，对样品水解度的影响又变得微弱.

图1 发酵时间对样品总蛋白含量和水溶性蛋白含量的影响

图2 发酵时间对样品水解度和pH 值的影响

高压蒸汽灭菌处理对样品的pH 值影响不大；随着发酵时间的增加，样品pH 值整体呈下降趋势.0～16 h，样品pH 几乎不变，略有下降；16～32 h，样品pH 快速下降；32～52 h，样品pH 继续下降且趋于平缓.

2.2 发酵对样品蛋白组成的影响

原料及发酵样品的SDS-PAGE 如图3 所示.

图3 原料及发酵样品的SDS-PAGE

由图3 可以看出，与原料泳道相比，高压蒸汽灭菌后的泳道总体色泽和高分子区色泽明显降低，发酵后的样品泳道总体色泽和高分子区色泽则进一步降低，这表明高压灭菌处理可以造成原料亚基的大幅度降解，对高分子亚基也有着很强的降解作用，而发酵则进一步深化了该降解过程.

观察Ara h 1 条带区发现：高压灭菌处理能够大幅度降低Ara h 1 的含量，发酵能继续降低Ara h 1 的含量.发酵8 h，Ara h 1 的含量进一步下降；发酵16 h 以后，Ara h 1 条带几乎消失（补充说明：由于在高压灭菌和发酵过程中，其他蛋白质可能降解产生与Ara h 1 亚基分子质量相似的亚基，所以除原料泳道外，其他泳道的Ara h 1 含量可能低于该泳道Ara h 1 条带区的蛋白含量）.

观察Ara h 2 条带区发现：高压灭菌及发酵后，Ara h 2 条带区的蛋白含量或增加或减少，变化没有规律性且变化幅度很大.出现上述情况的原因是：试验采用的花生蛋白中，分子质量高于Ara h 1 亚基（63.5 ku）的蛋白亚基含量很低，因此Ara h 1 条带区受到其他蛋白质降解产物的影响很小；但是Ara h 2 的分子质量相对较小（16～17 ku），且分子质量高于Ara h 2 的亚基含量很高且降解充分，所以Ara h 2 条带区受到其他亚基降解产物的影响很大.考虑到微生物降解一般不会再产生Ara h 2，所以如果Ara h 2 条带区蛋白含量降低，该泳道Ara h 2 的含量一定至少发生该幅度的降低；Ara h 2 条带区蛋白含量增高，该泳道Ara h 2 的含量并没有增多，应该是由分子质量更大的亚基降解的结果.所以，发酵可以降低Ara h 2 的含量，发酵至多36 h，Ara h 2 的含量已显著下降.

综上，高压灭菌处理和继续发酵能显著降低Ara h 1 和Ara h 2 的含量.又由于高压灭菌处理和继续发酵对花生蛋白有着很好的降解效果，发酵还可以显著增加样品的水可溶性蛋白含量及水解度.因此，高压灭菌处理加继续发酵很可能降低Ara h 1 和Ara h 2 的致敏性.由于Ara h 1 和Ara h 2 是常用的衡量花生产品致敏性的标志，因此在试验条件下的枯草芽孢杆菌发酵很可能能够降低花生蛋白的致敏性.

2.3 感官评价（表1）

由表1 可知，高压蒸汽灭菌和发酵0～8 h，样品的感官特性没有明显变化，容易被消费者接受.发酵16～32 h，样品除了保持原有的花生醇香，色泽还发生了诱人的变化并且开始出现令人舒服的微酸味，是消费者最乐于接受的阶段.发酵36～44 h，样品逐渐产生腥味和臭味，花生香味开始减弱，酸味开始增强，颜色逐渐变为棕色，但总体上还尚可接受.发酵48 h 以后，样品产生浓酸味，逐渐产生很浓的腥臭味，花生香味逐渐消失，色泽变为深棕色，整体上已经无法让消费者接受.因此，感官评价最好的是发酵16～32 h.

2.4 综合评价

综合总蛋白含量、水溶性蛋白含量、致敏性、感官评价4 个指标对发酵样品及原料进行综合评价.总蛋白含量可视为基本一致；致敏性方面，发酵16 h 以后可以视为一致；水溶性蛋白含量上，随着发酵时间的延长不断增加；感官评价方面，发酵16～32 h 最好.因为食品的感官特性尤为重要，又由于发酵16～32 h，水溶性蛋白已经达到很高的水平，所以相比水溶性蛋白含量，应该把感官评价作为优先考虑的因素.因此，确定发酵最优时间为

16～32 h.

3 结论

作者研究了枯草芽孢杆菌发酵对花生蛋白致敏性及产品特性的影响.研究发现，高压蒸汽灭菌对原料的总蛋白含量、水溶性蛋白含量、水解度、pH 值、感官评价均无影响；但可以显著降低Ara h 1 和Ara h 2 的含量.枯草芽孢杆菌继续发酵，对样品的总蛋白含量几乎无影响，但可以显著增加样品的水溶性蛋白含量和水解度，让样品pH 值降低并趋于稳定，几乎清除Ara h 1，进一步明显降低Ara h 2，很可能降低样品的致敏性，并且对样品的感官特性产生显著影响（更加怡人到不可接受）.综合评价，本试验条件下发酵的最优时间为16～32 h.

4 展望

总体来说，枯草芽孢杆菌发酵基本不影响样品的总蛋白含量，但可以显著增加样品的水溶性蛋白含量，大幅度提高水解度，很有可能能够降低样品的致敏性，并且还可以增加样品的风味和色泽，有可能是一种降低花生蛋白致敏性的有效方法.

但本研究只是对该问题的初步探索，可望在后续研究中进行ELISA 检测及动物过敏试验以验证枯草芽孢杆菌发酵在降低花生蛋白致敏性方面的作用.此外，还应对产品特性的变化机理进行研究，并对产品的其他特性（如功能肽含量、乳化性、起泡性等）进行测定以便达到更全面的评价枯草芽孢杆菌发酵的效果.

［1］Sicherer S H，Munoz-Furlong A，Godbold J H，et al.US prevalence of self-reported peanut，tree nut，and sesame allergy:11-year followup［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2010，125（6）:1322-1326.

［2］Ben-Shoshan M，Kagan R S，Alizadehfar R，et al.Is the prevalence of peanut allergy increasing？A 5-year follow-up study in children in Montreal［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2009，123（4）:783-788.

［3］Shek L P，Cabrera-Morales E A，Soh S E，et al.A population-based questionnaire survey on the prevalence of peanut，tree nut，and shellfish allergy in 2 Asian populations［J］.Journal of Allergy and Clinical Immunology，2010，126（2）:324-331.

［4］King R M，Knibb R C，Hourihane J O.Impact of peanut allergy on quality of life，stress and anxiety in the family［J］.Allergy，2009，64（3）：461-468.

［5］IUIS Allergen Nomenclature Sub -Committee.Search results of peanut allergens［DB/OL］.（2013 -06 -04）［2013 -06 -30］.http://www.allergen.org/search.php?Allergensource=Arachis+hypogaea.

［6］Chu Y，Faustinelli P，Ramos M L，et al.Reduction of IgE binding and nonpromotion of Aspergillus flavus fungal growth by simultan -eously silencing Ara h 2 and Ara h 6 in peanut［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（23）:11225-11233.

［7］Chung S Y，Champagne E T.Using magnetic beads to reduce peanut allergens from peanut extracts［J］.Journal of Allergy Clinical Immunology，2010，125（2）:AB223.

［8］Cabanillas B，Maleki S J，Rodrguez J，et al.Heat and pressure treatments effects on peanut allergenicity［J］.Food Chemistry，2012，132（1）:360-366.

［9］Ahmedna M，Yu J M，Goktepe I.Process for preparing hypoallergenic and non -allergenic peanut butter and associated products:USA，US2010/0080870 A1［P］.2010-04-01.