刘鹏娟，黄 山，朱 玲＊，周远成，卓秀萍，覃娟娟，顾 凡

（1.四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安625014；2.四川省雅安市石棉县畜牧局，四川雅安625400）

猪呼肠病毒（Porcine reovirus）为正呼肠病毒属成员，属于分节段的双链RNA（dsRNA）病毒［1］。该类病毒最早于20世纪50年代从人的呼吸道与胃肠道被分离出来，证实了dsRNA 病毒能够以稳定的生命形式存在于自然界。呼肠病毒的宿主谱极为广泛，可从人和多种哺乳动物（如猪、牛、犬等）及禽体内分离。此外，从河水、污水中也能检出呼肠病毒。目前已报道的猪源呼肠病毒共3个血清型［2］，广泛存在于猪群。Kasza等1970 年分别报道了血清1型，Robl等1971年报道了血清3型，Fukutomi T 等1996年在日本首次报道了血清2 型。猪感染呼肠病毒后多数不表现明显的临床症状，但严重者可引起呼吸系统或胃肠道疾病［3-4］。用呼肠病毒1 型感染猪可再次从其粪样中检出病毒，同时仔猪体温很快升高且具有传染性，提示人们需谨慎对待呼肠病毒，并应对其与发病猪的关系做进一步研究。

1 形态特征

负染电镜下，猪呼肠病毒为5∶3∶2立体对称的二十面体球形颗粒，无囊膜，直径约65nm～72 nm。呼肠病毒颗粒由内衣壳与外衣壳组成，其中内衣壳含10条dsRNA 基因组［5］。电镜和三维重构映像分析及X 射线晶体衍射表明，呼肠病毒外衣壳以不完全的T＝13对称排列，内衣壳以T＝1或T＝2对称排列。

2 理化特性

猪呼肠病毒在pH 3.0～9.0范围内较稳定，对氯仿、乙醚和胰蛋白酶均具抵抗力，50℃加热1h易失活，属中度耐热，紫外线可灭活病毒。完整病毒粒子在氯化铯密度梯度离心时的浮力密度为1.36g／mL。病毒核心能够合成RNA 聚合酶，该酶于28℃时活性最强，且稳定性可保持14h以上。病毒毒力差异与保存时间、温度有关。猪呼肠病毒具有血凝性，在4℃、22℃、37℃时能够凝集人O 型及猪红细胞［6-7］。

3 培养特性

小鼠L929纤维原细胞系可培养猪呼肠病毒，可用于病毒的生长、纯化和空斑试验。目前多用Vero细胞（培养液中添加胰酶）对病毒进行培养和分离鉴定［8］。呼肠病毒复制比较缓慢，多数新生病毒（约80%）在细胞内存活，其引起的细胞病变取决于所用的细胞系。通常感染细胞出现以稳定的细胞颗粒增多、肿胀、变圆、漂落等为特征的细胞病变。姬姆萨染色可观察到嗜酸性胞质内包涵体［9］。感染细胞中，特征性微管样结构明显，病毒粒子多数以晶格状排列，大小约70nm。

4 临床症状与病理变化

4.1 流行病学与临床症状

呼肠病毒在猪群中流行普遍，3 种血清型的抗体在猪体内都可检测到。该病毒经口粪途径或呼吸道感染［10］。新生仔猪体内的母源抗体可维持11周左右，任何年龄猪对呼肠病毒都有易感性。从患呼吸道或胃肠道疾病的猪、流产胎儿、临床健康的猪体内都可分离出呼肠病毒。用1型呼肠病毒对1周龄～6周龄哺乳仔猪进行鼻内、腹腔或脑内接种，多不表现明显临床症状，或少数出现轻度发热。接种24 h后，病毒可经消化道与呼吸道排出体外，并持续6d～14d［11］。断奶仔猪鼻内接种1型呼肠病毒，通常表现轻微呼吸道症状，以发热、打喷嚏、精神沉郁、食欲不振等为主要特征。用3型呼肠病毒对怀孕40d～85d的经产母猪进行肌肉或静脉注射，可引发弱胎、死胎或木乃伊胎等，病毒可从母猪胎盘和流产排泄物中分离。

4.2 病理变化

猪感染呼肠病毒后很少出现明显病理变化，一般只显示轻微的显微病变［12］。1周龄未哺乳仔猪经口感染猪源呼肠病毒可引起空肠与回肠绒毛萎缩。用1型呼肠病毒感染4周龄SPF猪，不会引起明显的全身性病变，但可导致肺部显微病变-淋巴细胞、巨噬细胞在肺部及肺泡间隔多灶性积聚以及支气管淋巴细胞肥大性增生。用3 型呼肠病毒对70kg SPF仔猪鼻内接种，可导致肺泡型肺气肿和支气管淋巴细胞肥大性增生，但各肺小叶之间的病变程度不同。

5 分子生物学特性

5.1 基因组特征

电镜及3′末端羟基定量分析表明，猪呼肠病毒全部的基因组由10条dsRNA 片段组成，包括L1，L2，L3，M1，M2，M3，S1，S2，S3和S4。由于病毒基因组的分节段性，导致不同病毒毒株具有高度变异性和复杂性。根据核酸电泳迁移率的不同，将猪呼肠病毒基因片段按分子质量大小分为3组，即3个大基因节段（L1、L2 和L3），3 个中基因节段（M1、M2和M3）和4个较小基因节段（S1、S2、S3和S4）。呼肠病毒的每个基因片段都有5′端（GGUAUU）和3′端（UGAU）的保守序列［11-13］。

5.2 基因编码蛋白及其功能

5.2.1 核衣壳组分λ1与σ2 猪呼肠病毒基因片段L3和S2分别编码λ1（142ku，1 275aa）和σ2（47 ku，418aa）［14］。λ1和σ2为病毒核心衣壳的主要结构蛋白，λ1为120 拷贝，σ2 有150拷贝。两者都能与病毒的双链RNA 结合，但σ2的结合能力弱于λ1蛋白，它们对病毒的转录、复制起着重要影响。λ1蛋白还具有解旋酶和NPT 酶特征序列，具备解旋酶与RNA 三磷酸酶两种酶活性［15］。由此证明，λ1蛋白在病毒转录中基因组负链的解旋及帽化过程参与了能量供应。研究发现［16］，仅将λ1 蛋白于鼠纤维原细胞中表达，不能形成20 面体颗粒。但若有σ2同步表达即可形成，表明σ2对呼肠病毒形成核衣壳构象有重要意义。

5.2.2 外壳钉状物突起λ2 呼肠病毒L2基因片段编码λ2蛋白（144ku，1 288aa），λ2有60拷贝，是五聚体蛋白。研究表明，λ2具有甲基化酶和鸟苷酸转移酶（即加帽酶）活性，在病毒mRNA 合成与外壳装配过程中起到重要作用。已证实，λ2与内衣壳蛋白λ1、λ3及外衣壳蛋白σ1、σ3、μl有较强的亲和作用与联系［17-18］。

5.2.3 微量核心组分λ3 与μ2 呼肠病毒微量核心组分λ3（142ku，1 267aa）和μ2（83ku，736aa）由基因片段L1和M1节段编码，在病毒中含量较低，分别有12拷贝和20拷贝。对于病毒结构的组装，这两种蛋白无明显框架作用，但具备非常重要的酶活功能。λ3 具有poly（C）依赖于poly（G）的RNA聚合酶活性，且在病毒复制中与λ1、λ2和μ1蛋白有相互作用。而μ2可作为一种调节蛋白，在病毒复制过程中协同λ1蛋白决定三磷酸核苷酶的活性［19］。

5.2.4 外衣壳结构蛋白 病毒蛋白μ1（76ku，708 aa）、σ1（50ku，455aa）、σ3（41ku，365aa）分别由基因片段M2、S1、S4编码，构成病毒外衣壳组分。μ1和σ3蛋白形成多聚体，是外衣壳蛋白的主要组分，二者均为600拷贝。μ1蛋白主要以μ1N（4ku）片段和μ1C（72ku）片段形式存在于病毒中，其功能是在病毒入侵宿主时参与穿过细胞膜屏障。μ1 裂解产生μ1C和μ1N，μ1C 可进一步裂解为δ和ψ。研究发现，μ1多肽链可形成4种不同结构域而造成蛋白构象的改变，其机制是为了保证病毒的膜穿透功能。σ3是病毒的主要结构蛋白，可与单链RNA 结合并控制翻译［18，20］。作为双顺反子的基因片段S1可编码σ1和σ1s，这两种蛋白决定病毒的感染性、致病力和毒力。σ1蛋白以三聚体形式出现，是一种细胞吸附蛋白，可在病毒入侵细胞时介导病毒与受体的结合，并能诱导细胞凋亡；σ1s蛋白可阻断细胞的生长周期。

6 致病机制

呼肠病毒可经两种途经入侵细胞，一是病毒粒子吸附于细胞表面的特异性受体，通过由受体介导的胞吞作用入侵细胞，并借助溶酶体中的蛋白酶降解自身外衣壳，形成具感染性的次病毒颗粒；二是部分病毒粒子在细胞外经蛋白酶降解生成ISVP 后直接入侵细胞，而不必依赖于由受体介导的胞吞作用［21］。

细胞凋亡是呼肠病毒对宿主造成组织损伤的主要机制［22-23］。呼肠病毒可以诱导多种细胞的体外凋亡，研究病毒感染的动物模型发现，细胞凋亡对心脏和大脑组织的损伤起重要作用。由于不同毒株的致病性不同，引起细胞凋亡的能力也不相同。呼肠病毒诱导细胞凋亡的效率取决于病毒与细胞表面受体结合的能力。此外，呼肠病毒可使细胞生长周期的G1、G2或M 期停止，不同毒株诱导生长周期停止的能力取决于可编码σ1和σ1s蛋白的S1 基因节段，σ1蛋白可诱导细胞生长停止于G1 期，而σ1s蛋白可诱导细胞生长停止于G2或M 期。

7 病毒检测

由于呼肠病毒导致猪的临床症状和病理变化都不具特征性，该病的诊断一般需要分离病毒。检测猪源呼肠病毒方法有很多，其中以电子显微镜技术最为直观有效。由于呼肠病毒形态特殊，电镜观察的特异性较强，所以是检测少量样品时最迅速的方法。

细胞培养分离病毒、补体结合试验、空斑试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法虽然较复杂，但仍是诊断猪源呼肠病毒的主要手段［24-26］。此外，现代分子生物学新技术的发展大大提高了检测效率。RTPCR 是近年来发展最迅速的检测技术，该方法可检测痕量样品，敏感性和特异性都很高，最小检测量可达0.1pg病毒核酸，是猪呼肠病毒检测技术发展的主要方向。血清学诊断也是检测猪源呼肠病毒的一种方法［27］。由于猪呼肠病毒可凝集人O 型及猪红细胞，可利用3种呼肠病毒的抗血清，通过病毒中和试验和血凝抑制试验来鉴别不同的血清型。

8 防控措施

呼肠病毒感染猪所致的呼吸系统和消化道疾病，目前尚无特异性的预防与治疗方法。由于国内外对防控该病毒感染的研究较少，可从分子水平对病毒与感染宿主的相互作用关系进行研究，进一步探究病毒的致病与免疫机制。具体可从分析不同分离株病毒基因所编码的蛋白与毒株毒力的相互关系、病毒与宿主的相互作用机制入手，为研究安全、高效、可靠的防控措施奠定基础［28］。

9 展望

针对呼肠病毒感染猪导致的疾病，目前尚无特异性的防控方法。随着现代分子生物学技术的发展，笔者对防控猪呼肠病毒感染提出新的思考：①由于编码σ1和σ1s蛋白的S1基因节段决定着病毒毒力，可通过选择性地抑制呼肠病毒S1基因的表达来降低病毒的致病性。例如，Shahi S 等［29］证实了核酶可有效抑制呼肠病毒的S1基因，利用核酶处理后的细胞来抑制病毒感染有望成为防控该病的新策略。②当今已有干扰载体面世，可尝试利用RNA干扰技术来抑制病毒的复制。猪呼肠病毒表达重要酶的序列具有高度保守性，可作为RNAi的靶基因，在复制早期发生抑制，以达到防控目的。③通过直接抑制细胞凋亡来降低病毒对感染组织的损伤，也可能为治疗提供新的思路。

猪呼肠病毒的基因组为dsRNA，RNA 病毒的快速进化和高适应能力很大程度上取决于它的高突变率。基因内突变可以是点突变、插入或缺失等。分节段RNA 病毒除基因突变外，还可发生基因重排，如流感病毒16种H 亚型和9种N 亚型可发生上百种排列组合。猪呼肠病毒基因组含10个dsRNA 节段，其突变方式既可是基因内突变，也可能是基因片段重排。何小明等［30］于仔猪腹泻粪样中分离出SHR-A 株病毒，研究发现其S1-S4基因片段存在基因突变和重排，还发现其S1基因是血清1型和3型的嵌合体，证明SHR-A 发生了基因重组。对猪源呼肠病毒的遗传变异和进化有待进一步深入研究。

［1］殷 震，刘景华，病毒学.动物病毒学［M］.北京：科学出版社，1997：1104-1130.

［2］Day J M.The diversity of the orthoreoviruses：Molecular taxonomy and phylogentic divides［J］.Infect Genet Evol，2009，9（4）：390-400.

［3］Wong A H，Cheng P K，Lai Mary Y Y，et al.Virulence potential of fusogenic orthoreoviruses［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（6）：944-948.

［4］Fukutomi T，Sanekata T，Akashi H.Isolation of reovirus type 2from diarrheal feces of pigs［J］.J Vet Med Sci Japan Soc Vet Sci，1996，58（6）：555-557.

［5］Reinisch K M，Nibert M L，Harrison S C.Structure of the reovirus core at 3.6Aresolution［J］.Nature，2000，404：960-967.

［6］Zhang C，Liu L，Wang P，et al.A potentially novel reovirus isolated from swine in northeastern China in 2007［J］.Virus genes，2011，43（3）：342-349.

［7］Roland J，Véronique S，Guy L.Amino acid substitutions inσ1 andμ1outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells［J］.Virus Res，2013，176（6）：188-198.

［8］Doyle J D，Danthi P，Kendall E A，et al.Molecular determinants of proteolytic disassembly of the reovirus outer capsid［M］.JBC，2012，287（6）：8029-8038.

［9］Sarkar P，Danthi P.Theμ1 72-96loop controls conformational transitions during reovirus cell entry［J］.J Virol，2013，87（24）：13532-13542.

［10］Yun T，Ye W，Ni Z，et al.Complete genomic sequence of goose-origin reovirus from China［J］.J Virol，2012，86（6）：10257.

［11］孙 颖，辛绍杰，貌盼勇.呼肠病毒的生物学特征及其致病性［J］.国外医学：流行病学传染病学分册，2005（3）：145-148.

［12］Dai Y，Zhou Q，Zhang C，et al.Complete genome sequence of a porcine orthoreovirus from southern China［J］.J Virol，2012，86（22）：12456.

［13］方 勤，朱作言.呼肠病毒结构与功能研究进展［J］.病毒学报，2003（4）：381-384.

［14］Coombs K M.Reovirus structure and morphogenesis［J］.Current Topic Microbiol Immunol，2006，309：117-167.

［15］Xu W，Coombs K M.Conserved structure／function of the orthoreovirus major core proteins［J］.Virus Res，2009，144（1）：44-57.

［16］Boehme K W，Lai C M，Dermody T S.Mechanisms of reovirus bloodstream dissemination［J］.Adv Virus Res，2013，87：1-35.

［17］Lorena V，Irene L，JoséM，et al.Different intracellular distribution of avian reovirus core protein sigmaA in cells of avian and mammalian origin［J］.Virology，2012，432（6）：495-504.

［18］张 云，刘 明，欧阳岁东，等.正呼肠病毒及其分类学依据研究进展［J］.动物医学进展，2004，25（6）：46-49.

［19］Kwon H J，Kim H H，Kim H J，et al.Detection and molecular chracterization of porcine type 3orthoreoviruses circulating in South Korea［J］.Vet Microbiol，2012，157（3）：456-463.

［20］Benavente J，Martínez-Costas J.Avian reovirus：structure and biology［J］.Virus Res，2007，123（2）：105-119.

［21］Schulz W L，Haj A K，Schiff L A.Reovirus uses multiple en-docytic pathways for cell entry［J］.J Virol，2012，86（6）：12665-12675.

［22］Andrea J P.Apoptosis induction influences reovirus replication and virulence in newborn mice［J］.J Virol，2013，87（6）：12980-12989.

［23］Danthi P，Holm G H，Stehle T，et al.Reovirus receptors，cell entry，and proapoptotic signaling［J］.Adv Exp Med Biol，2013，790：42-71.

［24］Zeng W W，Wang Q，Wang Y Y，et al.A one-step molecular biology method for simple and rapid detection of grass carpCtenopharyngodon idellareovirus（GCRV ）HZ08strain［J］.J Fish Biol，2013，82（5）：1545-1555.

［25］Jason A I，Janet Z W，John G，et al.A rapid，automated approach for quantitation of rotavirus and reovirus infectivity［J］.J Virol Meth，2012，184（6）：1-7.

［26］曾智勇，郭万柱，徐志文，等.猪呼肠病毒SC-A 株的分离鉴定及σ2 基因的克隆与序列分析［J］.中国兽医学报，2008，28（7）：799-808.

［27］曾智勇，郭万柱，徐志文，等.仔猪腹泻粪样中猪呼肠病毒的分离鉴定［J］.畜牧兽医学报，2007（6）：574-580.

［28］Maitra R，Ghalib M H，Goel S.Reovirus：a targeted therapeutic--progress and potential［J］.Mol Cancer Res，2012，10（6）：1514-1525.

［29］Shahi S，Shanmugasundaram G K，Banerjea A C.Ribozymes that cleave reovirus genome segment S1 also protect cells from pathogenesis caused by reovirus infection［J］.Proceed Nat Acad Sci，2001，98（7）：4101-4106.

［30］何小明，姚火春，张洪彪，等.一株猪源1型呼肠病毒的分离及鉴定［J］.中国兽医科学，2013（1）：22-29.