，，

(青岛大学医学院附属青岛市立医院普外科，山东 青岛 266071)

神经前体细胞发育下调表达蛋白(NEDD9)是CAS 家族成员之一。近年研究显示，NEDD9在乳癌、侵袭性黑色素瘤、肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤组织中呈高表达状态[1-6]，并且与肿瘤的侵袭转移密切相关；NEDD9的作用与细胞的黏附、迁移、侵袭、细胞凋亡和上皮-间质转化(EMT)有关[1,7]；NEDD9与非小细胞肺癌预后相关，高表达的NEDD9可以作为一个独立的判断预后的指标[8]。NEDD9可以作为预测肿瘤病人预后的标记物，但NEDD9在结直肠癌侵袭转移及预后中的作用尚不清楚。本文应用免疫组化方法，检测NEDD9在结直肠癌组织中的表达情况，并分析其与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2007年1月—2008年9月，选取在我科行手术治疗、术后病理确诊为结直肠癌组织及其正常组织(距肿瘤组织距离>5 cm)标本各92例。其中男52例，女40例；年龄23～82岁，平均62岁。术后病理类型：黏液腺癌12例，管状腺癌77例，乳头状腺癌3例。肿瘤部位：57例位于乙状结肠或直肠，26例位于右半结肠，9例位于左半结肠。肿瘤分期：Ⅰ期15例,Ⅱ期30例,Ⅲ期37例,Ⅳ期10例。所有病例均为原发肿瘤，临床病理资料及随访资料完整，通过电话或门诊方式随访止2013年9月。平均随访时间51.2个月，失访5例，失访率5.4%。肿瘤分期参照2012版美国结直肠癌诊疗指南(NCNN)。

1.2 NEDD9检测方法

采用免疫组织化学方法。结直肠癌组织及正常组织标本4 μm连续切片，石蜡切片常规脱蜡、水化，PBS清洗后用pH值为6的柠檬酸修复液在高压锅中进行抗原修复，再次PBS清洗后用体积分数0.03的H2O2室温下孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS清洗后用体积分数0.10正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min，倾去 血清，勿洗。滴加一抗工作液，4 ℃过夜。第2天滴加二抗，室温下孵育15 min，PBS清洗后进行DAB染色，自来水充分冲洗终止染色，然后行复染、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

每张切片均由两名病理医师双盲阅片。在40倍显微镜下，计数10个视野阳性细胞所占比例及视野综合染色强度，并进行评分。阳性细胞数评分：0分，阳性细胞所占比例<10%；1分，阳性细胞所占比例10%～25%；2分，阳性细胞所占比例26%～50%；3分，阳性细胞所占比例>50%。细胞染色强度评分：0分，无色；1分，染色淡黄色；2分，染色黄色；3分，染色棕黄色。根据染色强度评分与阳性细胞数评分的乘积计算最终得分，0～3分为NEDD9低表达，4～9分为NEDD9高表达。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验，生存分析采用Cox单因素及多因素分析，生存曲线应用Kaplan-Meier方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NEDD9在结直肠癌组织中的表达

NEDD9阳性表达主要位于细胞质，在结直肠癌组织中有68例高表达，在癌旁正常组织中有12例高表达，结直肠癌组织与癌旁正常组织NEDD9表达比较，差异有显著性(χ2=65.35，P<0.01)。

2.2 结直肠癌组织NEDD9表达与临床病理特征的关系

结直肠癌组织NEDD9表达与肿瘤TNM分期以及其中的pT、pN、pM有关(χ2=3.960～11.476，P<0.05)，与年龄、性别、部位及病理类型无关(P>0.05)。见表1。

2.3 结直肠癌病人NEDD9表达与预后的相关性

Kaplan-Meier生存分析显示，NEDD9低表达和高表达结直肠癌病人的5年生存率分别是62.5%和35.3%，Log Rank检验显示两组病人生存曲线差异有显著性(χ2=7.162，P<0.01)。见图1。Cox单因素和多因素分析显示，NEDD9表达和TNM分期是判断结直肠癌病人预后的独立因素。见表2。

3 讨 论

尽管外科手术及放化疗技术逐步发展，但局部复发及远处转移仍然是结直肠癌病人死亡的主要因素。CEA、CA199和CA125已广泛应用于结直肠癌病人随访，但仍不能准确预测复发和转移[9]。因此，急需新的标记物监测结直肠癌病人疗效及判断预后。本文的研究结果显示，NEDD9在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，差异有显著意义；NEDD9高表达与肿瘤的进展密切相关，随着肿瘤TNM分期的增加，NEDD9的表达增加；生存分析结果显示，NEDD9高表达的结直肠癌病人与低表达的病人相比5年生存率更低；多因素分析结果显示，NEDD9可以作为判断结直肠癌预后的独立因素。本文的研究结果与文献报道相似[1-4]。说明NEDD9表达与结直肠癌的进展和预后密切相关， NEDD9高表达的结直肠癌病人更容易出现肿瘤进展与转移，进而导致较差的预后。

表1结直肠癌病人NEDD9表达与临床病理特征的相关性(例)

临床病理参数nNEDD9高表达χ2值P值年龄(岁) <603828 ≥6054400.0020.967性别 男5239 女40290.0730.787病理类型 管状腺癌7757 黏液腺癌129 乳头状腺癌320.0900.956部位 乙状结肠和直肠5741 右半结肠2620 左半结肠970.3080.857TNM分期 Ⅰ157 Ⅱ3021 Ⅲ3730 Ⅳ101010.6300.014pT T184 T2157 T33225 T4373211.4760.009pN N04528 N12823 N219188.6280.013pM M08258 M110103.9600.047

图1 结直肠癌病人NEDD9高表达与低表达者5年生存曲线比较

表2结直肠癌病人5年生存率单因素和多因素Cox比例风险分析

影响因素单因素RR95%CIP值多因素RR95%CIP值年龄1.0030.968～1.0210.838性别1.3220.974～1.0330.326病理类型1.4350.590～3.4900.980部位0.7300.387～1.3760.330TNM分期1.5041.033～1.3760.0441.4721.018～2.1300.040NEDD9表达2.1911.020～4.7080.0332.4351.120～5.2950.025

NEDD9最早发现在小鼠早期胚胎的大脑组织中表达，现研究证实其存在于所有的脊椎动物中。在人正常组织中，NEDD9的mRNA及蛋白产物主要集中在肺、肾、含有大量未成熟淋巴样细胞组织及胚胎期大脑组织(成人大脑含量降低)。已有研究结果显示，NEDD9参与成胶质细胞瘤、黑色素瘤、乳癌的转移过程，认为NEDD9与肿瘤细胞的侵袭、迁移、转移有关。SIMA等[6]研究结果显示，骨架蛋白NEDD9在宫颈癌组织中高表达，高表达的NEDD9 能够促进宫颈癌细胞的迁移与侵袭，这可能是通过黏着斑激酶(FAK)与酪氨酸激酶(SRC)的磷酸化及EMT作用实现的。KIM等[4]研究显示，NEDD9表达与黑色素瘤的转移有密切关系，在体内、体外试验中都能够增强肿瘤细胞的侵袭性；转移的黑色素瘤与原发黑色素瘤相比较，NEDD9有更高的表达强度。KONG等[2]研究显示，NEDD9在进展期乳癌组织中高表达，NEDD9通过上调EMT促进肿瘤的侵袭与转移。

肿瘤的增殖、侵袭与转移是一个复杂连续的过程。NEDD9在其中的作用机制仍然不清楚。可能是FAK与SRC磷酸化及EMT共同作用的结果。目前，多个研究小组一致认为，细胞的黏附作用能够引发SRC、NEDD9和FAK的相互作用，三者中任何一种蛋白的高表达或异常激活都能够促进FAK-CRK-SRC复合物的形成，它们的相互作用提高了SRC和FAK的活化作用，促进NEDD9广泛的磷酸化，进而在SH2结构域中为效应蛋白创造结合位点。SIMA等[6]研究结果显示，NEDD9的磷酸化与 FAK或SRC可能存在正反馈循环。肿瘤的侵袭通常需要EMT，细胞失去相互附着的能力，更加具有活动性。张红梅等[10]研究结果显示，EMT的发生率与胰腺癌的转移有密切联系，EMT在胰腺癌的分化、浸润和转移中起到重要作用。EMT能下调细胞之间起黏附作用的E-钙黏蛋白，导致细胞黏着连接不稳定。TIKHMYANOVA 等[3]的研究结果显示，NEDD9是通过SRC将E-钙黏蛋白从细胞膜表面移除并被溶酶体溶解。

综上所述，NEDD9参与了结直肠癌的进展与转移，并能够准确判断预后；NEDD9可作为判断预后的标记物并可为结直肠癌病人提供一个新的分子治疗靶点。

[参考文献]

[1]IZUMCHENKO E, SINGH M K, PLOTNIKOVA O V, et al. NEDD9 promotes oncogenic signaling in mammary tumor development[J]. Cancer Res, 2009,69(18):7198-7206.

[2]KONG C, WANG C, WANG L, et al. NEDD9 is a positive regulator of epithelial-mesenchymal transition and promotes invasion in aggressive breast cancer[J]. PLoS One, 2011,6(7):e22666.

[3]TIKHMYANOVA N, GOLEMIS E A. NEDD9 and BCAR1 negatively regulate E-cadherin membrane localization, and promote E-cadherin degradation[J]. PLoS One, 2011,6(7):e22102.

[4]KIM M, GANS J D, NOGUEIRA C, et al. Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene[J]. Cell, 2006,125(7):1269-1281.

[5]CHANG J X, GAO F, ZHAO G Q, et al. Expression and clinical significance of NEDD9 in lung tissues[J]. Med Oncol, 2012,29(4):2654-2660.

[6]SIMA N, CHENG X, YE F, et al. The overexpression of scaffolding protein NEDD9 promotes migration and invasion in cervical cancer via tyrosine phosphorylated FAK and SRC[J]. PLoS One, 2013,8(9):e74594.

[7]SINGH M, COWELL L, SEO S, et al. Molecular basis for HEF1/NEDD9/Cas-L action as a multifunctional co-ordinator of invasion, apoptosis and cell cycle[J]. Cell Biochem Biophys, 2007,48(1):54-72.

[8]KONDO S, IWATA S, YAMADA T, et al. Impact of the integrin signaling adaptor protein NEDD9 on prognosis and metastatic behavior of human lung cancer[J]. Clin Cancer Res, 2012,18(22):6326-6338.

[9]BOLOCAN A, ION D, CIOCAN D N, et al. Prognostic and predictive factors in colorectal cancer[J]. Chirurgia (Bucur), 2012,107(5):555-563.

[10]张红梅,王骥平,陈德利. 上皮-间质转化与胰腺癌生物学行为的关系[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(6):474-475,478.