胡秋实，苏忠亮，李 江

（1.青岛科技大学化工学院，山东青岛266042；2.国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061）

生活在极端环境中的微生物为了适应其生存环境，需要分泌特殊的酶类以及其它代谢产物，这些酶类和代谢产物所具有的特殊性质在工业生产中具有很大的应用价值［1－3］。

卡拉胶是从红藻细胞壁中提取的以重复的1，3－β－D－吡喃半乳糖和1，4－α－D－吡喃半乳糖二糖单元为基本骨架交互连接而成的亲水性线性硫酸多糖［4］，应用于食品、医药、化妆品等众多领域。卡拉胶寡糖主要由卡拉胶经酶降解得到，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗凝血以及免疫调节等多种生物活性［5－8］，在医药领域的应用价值非常高。作者在此对印尼热泉和北极海水这两种极端环境的微生物产卡拉胶酶进行了研究。

1 实验

1.1 菌株与培养基

菌株分离自印尼热泉水样和北极海水水样，保存于国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室超低温冰箱（－80℃）。

YN液体培养基（g·L－1）：蛋白胨3，酵母粉3，氯化钠3，蒸馏水配制。

YN固体培养基（g·L－1）：蛋白胨3，酵母粉3，卡拉胶15，琼脂粉15，氯化钠3，蒸馏水配制。

YN斜面固体培养基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，琼脂粉15，氯化钠3，蒸馏水配制。

2216E液体培养基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，陈海水配制。

2216E固体培养基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，卡拉胶15，琼脂粉15，陈海水配制。

2216E斜面固体培养基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，琼脂粉15，陈海水配制。

1.2 方法

1.2.1 富集培养

取印尼热泉／北极海水水样0.1mL，加至含有30 mL YN／2216E液体培养基的100mL三角瓶中，于55℃／10℃以150r·min－1培养24h／48h。

1.2.2 初筛

用无菌生理盐水适当稀释富集培养印尼热泉／北极海水菌液，取0.1mL稀释的菌液涂布于YN／2216E固体培养基平板中，于55℃／10℃恒温培养24 h／48h；挑取单菌落划线至YN／2216E固体培养基，于55℃／10℃恒温培养24h／48h；将形成的单菌落挑至YN／2216E斜面固体培养基保藏，同时对单菌落进行卢戈氏碘液染色，观察菌落周围是否出现透明圈。

1.2.3 复筛

将具有卡拉胶降解活性的印尼热泉／北极海水菌株划线于YN／2216E固体培养基平板中，于55℃／10℃培养24h／48h，挑取单菌落于YN／2216E斜面固体培养基保藏，并对平板进行卢戈氏碘液染色，进行活性验证，确定透明圈大小。

1.2.4 酶活的测定

采用DNS法：取0.5mL印尼热泉／北极海水菌株的酶液加入到1mL卡拉胶底物（含0.2%卡拉胶的0.2mol·L－1Glycine－NaOH缓冲溶液，pH值9.0）中，于55℃／10℃反应15min，以100℃灭活10 min的酶液作对照，取1mL反应物与1.5mL DNS试剂分别加入比色管中，沸水浴中加热5min，立即冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，摇匀，以分光光度计于520nm处测光吸收值。

1个酶活力单位（U）定义为：在55℃／10℃下，1 min产生1μg的还原糖（以D－半乳糖计）所需要的酶量［9］。

根据半乳糖标准曲线确定产生的还原糖量。

1.2.5 卡拉胶酶的最适反应温度测定

将酶液与底物分别在温度为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应，其它条件不变，测定卡拉胶酶活性，确定卡拉胶酶的最适反应温度。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

2.1.1 印尼热泉产卡拉胶酶菌株的筛选

通过稀释涂布及划线分离的方法从印尼热泉水样中获得了84株菌，其中14株具有卡拉胶降解活性，进一步通过平板划线与卢戈氏碘液染色相结合的方法进行复筛，结果如表1所示。

表1 印尼热泉产卡拉胶酶菌株的筛选结果Tab.1 Screening of strains from Indonesian hot springs with carrageenase－producing activity

从表1可以看出，从印尼热泉水样中筛选出14株具有卡拉胶酶活性的菌株，其中，3株具有较弱的卡拉胶酶活性，7株具有一定的卡拉胶酶活性，4株具有较强的卡拉胶酶活性，选择活性较强的菌株LI AIR 50－1、LI seawater－3、LI seawater－1和LI compur 50－1进行后续研究。

2.1.2 北极海水产卡拉胶酶菌株的筛选

通过稀释涂布及划线分离的方法从北极海水水样中获得了157株菌，其中24株具有卡拉胶降解活性，进一步通过平板划线与卢戈氏碘液染色相结合的方法进行复筛，结果如表2所示。

表2 北极海水产卡拉胶酶菌株的筛选结果Tab.2 Screening of strains from the Arctic seawater with carrageenase－producing activity

从表2可以看出，从北极海水水样中筛选出24株具有卡拉胶酶活性的菌株，其中，11株菌具有较弱的卡拉胶酶活性，9株具有一定的卡拉胶酶活性，4株具有较强的卡拉胶酶活性，选择活性较强的菌株CC1－2－3、BL09－3－5、BL09－8－2、C03－4－3进行后续研究。

2.2 不同极端环境菌株产卡拉胶酶的最适反应温度（图1）

从图1可以看出，印尼热泉菌在10℃时酶活性较低，随着温度的升高酶活性上升，在70℃达到最高；而北极海水菌在20℃时具有最高的酶活性，随着温度的升高，酶活性逐渐降低直至70℃失活。

2.3 讨论

本研究选取印尼热泉水样和北极海水水样中的微生物作为研究对象，筛选出了具有产卡拉胶酶能力的14株印尼热泉菌和24株北极海水菌。经过形态观察，生理生化特性和16SrDNA序列分析，发现印尼热泉菌均为Bacillus属和Anoxybacillus属，这些菌的最适生长温度均为55℃，其中产卡拉胶酶量最高的菌株为LI compur 50－1、LI seawater－1、LI seawater－3和LI AIR 50－1，经初步鉴定都属于Anoxybacillus属，其产卡拉胶酶的酶活力分别为15.4U·mL－1、14.3U· mL－1、15.8U·mL－1、14.8U·mL－1。这4株菌产生的卡拉胶酶的最适反应温度均在70℃以上，远高于一般的卡拉胶酶［10－15］，较高的热稳定性使得它们可以在高温的工业环境中发挥催化作用。北极海水菌均为Pseudoalteromonas属，这些菌的最适生长温度均为10℃。其中产卡拉胶酶量最高的菌株为C03－4－3、BL09－3－5、CC1－2－3、BL09－8－2，其产卡拉胶酶的酶活力分别为16.1U·mL－1、17.5U·mL－1、19.5U· mL－1、16.2U·mL－1。这4株菌产生的卡拉胶酶的最适反应温度均为20℃左右，低于一般动植物来源的卡拉胶酶［10－15］，不仅可以在低温环境下发挥催化作用，而且其热稳定性较低，只需通过温和的热处理就可使酶失活，快速而经济地终止反应。

图1 反应温度对不同极端环境菌株产卡拉胶酶活性的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on the activity of carrageenase produced by different extreme environment strains

3 结论

以实验室保存的印尼热泉水样和北极海水水样中的微生物为对象，通过平板划线、卢戈氏碘液染色和发酵上清液酶活测定等一系列定性定量相结合的方法，从两种极端环境水样中各筛选出4株具有高产卡拉胶酶能力的菌株，其中印尼热泉菌和北极海水菌所产的卡拉胶酶的最适反应温度分别为70℃和20℃，这两种酶分别对于高温和低温环境的工业生产具有非常大的应用价值。

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