林青，刘素芝

（台州医院 神经内科，浙江 台州 317000）

癫痫是一种由大脑神经元异常放电所引起的突然、短暂、反复发作的脑部功能失常的综合征。癫痫病理机制十分复杂，包括神经细胞凋亡、神经胶质再生、炎症反应等，其分子机制涉及基因转录、翻译、翻译后修饰等遗传信息链中的多个环节。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与细胞增殖和分化、凋亡、胚胎发育及疾病发生等一系列重要的生命过程。近年来研究表明miRNA与神经系统发育紧密相关，同时有研究显示miRNA在癫痫发生、发展过程中起着重要的调控作用。现对miRNA在癫痫调控中的作用研究进展进行综述。

1 miRNA的生成及作用机制

miRNA是一类进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，由21～25个核苷酸组成。miRNA在RNA聚合酶II作用下，由编码miRNA的基因转录生成初级miRNA。初级miRNA随后在RNA核酸内切酶Drosha和RNA绑定蛋白DiGeorge关键区域8（RNA binding protein DiGeorge critical region-8，DGCR8）作用下剪切成长度为60～70个碱基大小的带有茎环结构的miRNA前体（precursor nliRNA，pre-miRNA），后者在转运蛋白Exportin5作用下，从细胞核内运输到细胞质中，经过Dicer酶识别后被剪切为成熟的双链miRNA。之后该双链RNA在解螺旋酶作用下生成成熟的miRNA和miRNA’，其中miRNA’被降解，miRNA则与相关蛋白形成RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）结合而发挥生物学效应。miRNA通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated regions，3’UTR）的碱基互补来识别靶基因，在转录或翻译水平上调控基因的表达，实现对细胞增殖、凋亡、分化等过程的调节。在哺乳动物的大脑组织中发现了大量组织特异的miRNA。这表明miRNA在中枢神经系统有着重要的特定的作用[1-3]。

2 miRNA参与癫痫的调控作用机制

大量研究表明，癫痫的发生与神经细胞的凋亡、突触联系重建、神经胶质纤维细胞增生、异常通路形成以及炎症反应密切相关[4-5]。反复的癫痫发作可导致大脑海马神经元凋亡，形成异常兴奋性突触环路，最终促进难治性颞叶癫痫形成。可见miRNA可能是通过调控神经细胞的凋亡、突触联系重建、神经胶质纤维细胞增生、炎症反应参与癫痫的发生发展。

2.1 miRNA参与调节癫痫介导的炎症反应 研究表明脑内的炎症过程是癫痫发作的一个重要机制。癫痫与炎症相互促进，相互发展，癫痫发作引起炎症，而炎症可促进神经细胞兴奋和癫痫发作。癫痫发生后会启动一系列炎症反应，导致炎症递质大量释放，炎症递质一方面可引起血管炎，破坏血脑屏障，加重脑水肿及神经损害；另一方面，炎症递质可调节兴奋性氨基酸的释放和影响离子通道结构和表达，从而增高神经元细胞兴奋性，进一步促进癫痫发作。所以，炎症反应对于癫痫发作的持续存在起着重要作用[6]。miR-146a和miR-155可能通过介导炎症反应参与癫痫的形成。

2.1.1 miR-146a：miR-146a作为一种调节Toll样受体信号通路和细胞因子受体信号通路的内源性调节因子已经得到证实[7]。因此miR-146a和人类炎症性疾病有密切关系。Vezzani等[8]发现啮齿类动物癫痫模型的神经胶质内炎症因子IL-lβ和TNF-α表达量明显升高，IL-lβ是一种促炎细胞因子，可通过加强谷氨酸的神经传递，在癫痫后可通过对神经元直接作用或通过星形胶质细胞对神经元的间接作用参与癫痫形成过程，提示炎症反应对癫痫的发生发展起重要的作用。Aronica等[9]在电刺激大鼠癫痫模型和癫痫患者研究发现癫痫发作后海马组织的miR-146a各时点均表达升高，且主要在星形胶质细胞活化区域表达。因此推测miR-146a可能通过调节炎症反应而调控癫痫的发生发展，但具体调节机制尚不清楚，可能与miR-146a降低NF-κB活性，抑制其靶基因IL-lβ表达有关。另外，Omran等[10]研究幼年大鼠的匹鲁卡品颞叶癫痫模型和儿童颞叶内侧癫痫（mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）时发现大鼠海马中IL-lβ在癫痫持续状态（status epilepticus，SE）急性期时（SE后2 h）表达最高，此时miR-146a则处于低水平；在恢复期（SE后3周），IL-lβ则下降至最低峰，此时miR-146a表达则上升至最高峰，提示miR-146a对炎症反应起负性调节作用。但在慢性期（SE后8周）IL-lβ逐渐升高，miR-146a逐渐下降，可能与急性炎症控制，自发性癫痫发作有关。颞叶内侧癫痫儿童海马中IL-lβ和miR-146a均高于正常组。这些研究提示miR-146a在癫痫过程中扮演“抗炎”角色，因此，对其进一步研究人们可能找到新的癫痫治疗策略。

2.1.2 miR-155：研究发现，miR-155也是一种炎症相关性miRNA[12]，miR-155与炎症因子TNF-α密切相关，两者相互调节，共同介导炎症反应。在内毒素小鼠休克模型中，miR-155过表达可增加TNF-α的表达，加重感染性休克[11]；在巨噬细胞炎性反应过程中，TNF-α可通过NF-κB和AP-1上调miR-155的表达，加重炎症反应[12]。而TNF-α被证实可促进癫痫发作，给杏仁核点燃癫痫大鼠腹腔注射TNF-α可显著延长痫性发作时间，可能的作用机制是TNF-α上调谷氨酸受体的表达[13]。这提示miR-155可能通过与TNF-α相互调节介导炎症反应参与癫痫发作。在幼鼠癫痫模型、儿童颞叶内侧癫痫患者、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和多药耐药相关蛋白8（Multi-drug resistance associated protein 8，MRP8）处理的星形胶质细胞中，Ashhab等[14]发现miR-155和TNF-α升高，推测两者调节癫痫后炎症反应，共同促进癫痫发生、发展。

2.2 miRNA通过细胞凋亡在癫痫发病中的作用 细胞凋亡是内部或外部信号诱导的程序性细胞死亡。DNA的损伤、低氧及葡萄糖的缺乏可以作为内部信号，介导内源途径，引起线粒体功能障碍，导致多种促凋亡蛋白的释放，近来研究表明细胞凋亡在癫痫发作过程中起着重要作用，癫痫发作后的部分神经元死亡通过细胞凋亡途径来实现，这一过程由Bcl-2、Bax等凋亡相关基因控制，细胞凋亡使神经元数目减少导致神经元间突触联系的重组及脑功能失常，进而诱发癫痫发作及难治性癫痫形成。miR-21、miR-34a和miR-184可能参与癫痫后神经元细胞凋亡的基因调控机制。

2.2.1 miR-21：miR-21是一种凋亡相关因子，Chan等[15]发现在神经胶质母细胞瘤患者组织中miR-21表达增加，当抑制miR-21表达可使Caspase-3活性增加，瘤细胞凋亡增加，表明miR-2l表达与细胞凋亡有密切关系。张忱等[16]在氯化锂匹鲁卡品致痫大鼠模型研究中发现SE后24 h的大鼠海马和外周血中miR-21的表达量下调，推测可能通过调控促凋亡基因而促进癫瘌持续状态后神经元的凋亡。Risbud等[17]通过对癫痫大鼠海马组织miRNA表达情况的研究，发现SE后48 h至3周大鼠海马组织miR-21升高，而神经营养因子（neurotrophins-3，NT-3）下降；同时，培养的海马神经元用KCl处理后，也发现miR-21升高，NT-3下降，然后他们应用生物信息学发现，miR-21对NT-3 mRNA3’UTR区具有抑制作用，提示癫痫后miR-21的升高与NT-3的降低有明显的相关，而NT-3具有神经保护作用，癫痫后NT-3的降低可促进神经元凋亡[18]。Peng等[19]在幼鼠癫痫模型和儿童颞叶内侧癫痫中也发现miR-21升高，并推测其通过下调NT-3表达发挥促凋亡作用。因此miR-21在癫痫后可能通过抑制NT-3表达发挥促凋亡作用。

2.2.2 miR-34a：miR-34最初是在秀丽隐杆线虫发现的一个进化保守的miRNA家族，在脊椎动物中miR-34基因有三个成员（miR-34a，miR-34b，miR-34c）。miR-34a是P53基因的靶目标，P53上调miR-34a的表达，从而抑制下游因子MAP3K9、Bcl-2等的表达，诱导细胞凋亡[20]。Sano等[21]在红藻氨酸（Kainate acid，KA）杏仁核致痫小鼠模型中发现癫痫后海马中miR-34a升高，而Map3k9蛋白及P53的靶基因p21表达降低，在SE前沉默P53后miR-34a表达下降。他们还发现，在SE前用miR-34a特异性拮抗剂Ant-34a沉默miR-34a可使SE后miR-34a下降，并使促凋亡因子caspase-3下调，但却未能减少海马神经元凋亡，尽管miR-34a的下调未能减少神经元凋亡，但是其对p53依赖的凋亡通路中抗凋亡因子的上调可以反映出miR-34a的下调在分子水平上的抗凋亡趋势。这一现象的发生可能与Ant-34a干预剂量不足有关，也可能与旁路代偿有关；此外，Hu等[22]也在匹鲁卡品致痫大鼠发现SE后miR-34a及caspase-3上调，Ant-34a下调miR-34a表达后，caspase-3表达下调，而Ant-34a下调miR-34a表达同时还减少SE后神经元凋亡。上述两者实验结果的差异可能由多方面原因造成：①实验模型差异，前者为杏仁核注射红藻氨酸诱导的边缘叶发作癫痫小鼠模型，后者为氯化锂-匹鲁卡品诱导的颞叶癫痫大鼠模型，miR-34a在两者模型中促凋亡作用的程度可能有差异。②取材时间不同，前者在SE后24 h取材，而后者在7 d后取材，两者海马内各种凋亡相关因子含量可能存在差异。③Ant-34a剂量差异，前者为0.5 nmol，而后者为1 nmol，对于抑制神经元凋亡，前者剂量可能不够。上述的研究表明miR-34a表达升高可促使癫痫后海马神经元凋亡。

2.2.3 miR-184：miR-184也是一种凋亡因子，研究发现在不同的肿瘤细胞中起的作用不同，在神经母细胞中miR-184过表达时可以引起瘤细胞的促凋亡效应[23]，而在舌鳞状细胞癌中体外抑制miR-184水平，可诱导细胞凋亡，阻碍舌鳞状细胞增殖，提示miR-184有抗凋亡作用[24]。Henshall等[25]研究红藻酸致痫小鼠预处理模型发现海马中miR-184表达升高3.26倍，其靶蛋白Akt显著降低，而抑制miR-184后，海马神经元凋亡显著增加，提示miR-184在癫痫预处理模型中具有抗凋亡作用。其作用机制尚不明确，可能与调控Numblike，促进神经元增殖有关[26]；但也有研究发现miR-184通过下调Akt蛋白促进神经细胞凋亡[23]。所以miR-184在癫痫预处理模型中抗凋亡作用机制需要进一步研究。

2.3 miRNA参与调控癫痫突触重塑 突触是由神经元轴突和其他神经元的树突或胞体形成的特殊结构，是神经元之间进行信息传递的枢纽。突触接受细胞外信号，引发其结构和功能的改变，包括树突的重塑、突触的形成、长时程增强（long-term potentiation，LTP）/长时程抑制（long-term depression，LTD）发生等，称为神经元可塑性。目前研究证实，在癫痫发作后，脑内神经元之间出现异常突触联系，形成病理性神经环路，这就是突触重塑，以苔藓纤维出芽为主要形式，突触重塑使癫痫反复发作，导致难治性癫痫[4]。因此，突触重塑的研究对于癫痫的发病机制及难治性癫痫治疗的探索具有重要意义。miRNA-134、miRNA-132、miRNA-124可能通过突触重塑机制参与癫痫发生发展。

2.3.1 miRNA-134：Schratt等[27]研究发现miR-134可调节树突棘的数量。miR-134靶基因是编码LIM区域激酶l（LIM-domain kinase 1，Limk1）的mRNA。miR-134能够通过抑制Limkl表达对海马神经元树突棘大小进行负调控。miR-134过表达后，树突棘变小。其机制可能为miR-134抑制Limkl的mRNA翻译，从而影响肌动蛋白解聚因子，调控肌动蛋白丝的动态平衡，最终影响树突棘的形态。而脑源性神经营养因子（brain derived neurophicfactor，BDNF）可以解除miR-134对Limkl的抑制，诱导树突棘生长、成熟和可塑性。miR-134因此调控树突棘大小和数量，在突触重塑中起重要调节作用。Jimenez-Mateos等[28]在KA小鼠颞叶癫痫模型及人类颞叶癫痫患者研究发现海马内miR-134升高，Limk1降低。用miR-134特异性拮抗剂ant-134沉默miR-134后发现，海马内Limk1水平恢复，神经元棘突密度显著降低，同时产生显著的抗癫痫及神经保护作用。他们又用细胞实验证实ant-134这一作用是通过恢复Limk1水平来实现。miRNA-134的上调也同样发生在幼鼠癫痫模型和儿童颞叶内侧癫痫中[19]。因此推测miRNA-134通过突触重塑在癫痫的发生发展中起着重要调节作用，而ant-134可抑制癫痫突触重塑的发生，具有抗癫痫及神经保护作用。

2.3.2 miRNA-132：miRNA-132也是树突棘调控因子，与突触重塑密切相关。研究发现miRNA-132能在BDNF诱导下，经cAMP效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）调控转录，抑制Rho家族的GTP酶激活蛋白（p250GAP）的合成，从而诱导活性-海马神经元树突分支及树突棘的生长。miR-132导入海马神经元可诱导突触的发生，而通过拮抗剂抑制miR-132表达则阻止了突触的发生。表明miRNA-132在神经元结构和功能可塑性调控过程中具有重要作用[29]。Scott等[30]发现大鼠边缘区皮质中miR-132过表达可引起短期记忆功能损害且可抑制边缘区皮质神经元LTP，这说明miR-132调控突触可塑性影响认知功能。Nudelman等[31]在匹鲁卡品癫痫小鼠模型中研究发现，致痫小鼠海马中miR-132升高，推测其可能参与癫痫后的突触重塑过程。而Jimenez-Mateos等[32]则发现沉默miR-132可减少癫痫小鼠神经元凋亡，这一神经保护作用可能通过p250GAP树突棘的调控来实现。此外，miRNA-132的上调也同样发生在幼鼠癫痫模型和儿童颞叶内侧癫痫中[19]。

2.3.3 miRNA-124：miR-124是脑内最丰富的一种miRNA，提示其在神经系统中可能发挥重要调节作用。研究发现miR-124可促进轴突生长，阻断其表达则抑制轴突生长并降低α-微管蛋白的表达[33]，说明miR-124参与神经细胞骨架结构、轴突生长的调节。Yang等[34]研究发现，EPAC基因无效突变小鼠的神经元突触传递和LTP功能异常，空间学习和社交能力降低，而敲除miR-124能逆转上述变化，恢复认知功能，表明miR-124参与突触长时程可塑性的调节而影响认知功能。这些研究结果表明miR-124与神经元突触重塑密切相关。在幼鼠癫痫模型和儿童颞叶内侧癫痫患者海马的研究中，Peng等[19]发现miR-124的表达上调，推测其可能参与癫痫后的突触重塑过程并因此进一步影响癫痫后的认知功能。

3 展望

mRNA调控着生物体的基因表达，参与人体的生理、病理以及生化反应调节。miRNA在癫痫的发生发展过程中扮演着重要角色，miRNA将有可能成为癫痫的新的诊断和治疗的靶点，但是由于miRNA及其靶基因调控网络的复杂，目前对于以miRNA为潜在靶点对癫痫进行诊断和治疗尚缺乏理论依据，需要进一步探讨。首先，miRNA影响癫痫病因的分子机制还有待更进一步的阐明，从而找到相对应的治疗靶点；其次，miRNA对癫痫的诊断价值如何，是否能够找到预测癫痫发生及造成脑损害生物学标记物，将为癫痫提供一种新的诊断策略；最后，探索基于内源性miRNA作用新技术平台并进行分子药物设计，找到合适的药物载体，开发新型即通过血脑屏障又具有较高的转染效率和较小的不良反应药物。综上所述，miRNA在临床诊疗癫痫方面的应用仍需要不断研究、探索、尝试，最终才能实现。目前虽然miRNA参与癫痫的调控作用机制的研究仍处于起步阶段，但是随着研究的不断深入，miRNA对癫痫的病理机制的深入揭示及癫痫临床诊疗的进步可能会起着巨大的促进作用。

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