(南华大学医学院病原生物学研究所,湖南衡阳421001)

日本血吸虫病(Schistosomiasis)是一种呈世界性分布、严重危害人类健康的人兽共患病,传播广泛,危害严重,至今仍然是世界上亟待解决的严重的公共卫生问题。人和动物等终宿主对人体血吸虫无先天性免疫,但是宿主感染血吸虫后对再感染可产生不同程度的抵抗力,而对再感染具有一定免疫力被称为伴随免疫(concomitant immunity)。伴随免疫是部分免疫,对血吸虫再感染的杀伤作用有限,并不能完全清除宿主体内虫体,如果未进行有效的治疗,血吸虫对宿主的损害会持续存在。目前,虽然吡喹酮等有效药物在治疗血吸虫病方面有很好的效果,但对血吸虫传播的控制仍存在许多问题,再感染需要再治疗,花费巨大,且反复治疗后血吸虫产生耐药性的可能性也不容忽视。组织蛋白酶B(cathepsin B,CB)属于半胱氨酸酶,对血吸虫组织蛋白酶B的研究显示其具有下列作用：直接破坏宿主红细胞,将宿主红细胞中的血红蛋白降解加以利用[1],促进虫体的生长发育及雌虫产卵[2];具有侵袭力,破坏宿主的物理屏障[3],有利于虫体在宿主组织内移行[4-6]。2004年本文课题组首次分离出Sjcb2(Schistosoma japonicum cathepsin B2,Sjcb2),并对其诱导BALB/c小鼠产生保护性免疫作用进行了初步研究,结果显示其具有一定的抗血吸虫感染作用,本文进一步研究了其在抗血吸虫再感染中的作用以及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNA3.1(+)质粒由本实验室保存;pBCsk+/Sjcb2(带有Sjcb2 cDNA全长的克隆重组质粒)由本室制备保存(基因登录号AY226984)。4～5周龄BALB/c雌性小鼠,由南华大学实验动物中心提供。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和抗鼠IgE抗体购自Promega公司,EcoRI、XhoⅠ酶购自Promega公司,质粒大量提取试剂盒购自广州东盛有限公司。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸引物的设计及合成 根据Genbank中日本血吸虫Sjcb2基因(序列号AY226984)全序列设计1对引物P1和P2,并在2个引物的5′端分别引入限制性内切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)酶切位点(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

1.2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒构建 用Sjcb2特异性引物P1、P2对目的基因进行PCR扩增及产物纯化,用EcoRⅠ和XhoⅠ分别对Sjcb2基因片段和pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切,分别回收和纯化目的基因与pcDNA3.1(+)质粒,按基因克隆方法进行连接和转化,筛选重组质粒,用PCR和双酶切法初步鉴定,经基因测序进一步确认。

1.2.3 质粒的大量制备 按照质粒大量提取试剂盒操作说明,大量制备pcDNA3.1(+)质粒和pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,蛋白核酸定量仪测定DNA纯度及含量,用生理盐水稀释至1 μg/μL。

1.2.4 动物分组与免疫 将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型：感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组(PZQ处理组)、Sjcb2联合吡喹酮处理组(Sjcb2联合PZQ处理组)。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1(+)空质粒。初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗。除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染。分别于第8周和第14周各组处死5只小鼠,收集成虫、肝脏组织和血清等标本待检测备用。

1.2.5 检测小鼠荷虫数和计算抗血吸虫再感染率用生理盐水经门静脉灌注,收集成虫并计数。分别计数初次感染和再次感染后血吸虫成虫数。

1.2.6 抗血吸虫再感染率的计算 R%=[1-(n1-n2)/N]×100%。“R”为抗血吸虫再感染率,“n1”为再次感染后血吸虫成虫数,“n2”为初次感染后血吸虫成虫数,“N”为感染对照组血吸虫成虫数。1.2.7 虫卵肉芽肿直径的测量 第14周行麻醉后处死小鼠,取小鼠肝脏左叶组织,经10%甲醛固定,进行石蜡包埋,制作5 μm厚的切片,HE染色,光镜下选单个虫卵肉芽肿测量最大直径,以30个单卵肉芽肿直径的均值(±s)表示。

1.2.8 血清抗体水平的检测 可溶性成虫抗原稀释至10 μg/mL,4℃包被过夜,ELISA法检测特异性抗体水平。

1.2.9 可溶性成虫抗原(SWA)的制备 采用门静脉灌注法,从重感染45天的家兔肝门静脉冲出血吸虫成虫,用生理盐水漂洗3次,然后加适量生理盐水于匀浆器中冰浴匀浆1 h,反复冻融3～5次,4℃中冷浸72 h,4℃10 000 rpm离心30 min,取上清液即为成虫抗原。在核酸蛋白分析仪上对SWA进行蛋白定量,蛋白含量为1.390 6 mg/mL,分装后-20℃保存备用。

1.3 统计学分析

统计学分析通过SPSS17.0软件进行分析,两两比较采用t检验,所得数据以±s表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 目的基因片段的体外扩增

采用PCR法特异性扩增Sjcb2基因片段,该片段分子量约为1 100 bp,与预期目的片段大小相符(图1)。

图1 Sjcb2基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳 1：PCR产物;2：阳性对照 3：DNA Markers

2.2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒的酶切和PCR鉴定

PCR产物与重组质粒EcoRI和XhoⅠ双酶切后的片段约1 100 bp与Sjcb2基因片段大小相符,测序证实序列正确(图2)。

图2 pcDNA3.1(+)/Sjcb2双酶切及PCR鉴定 1：DNA Makers;2：重组质粒 pcDNA3.1(+)/Sjcb2;3：pcDNA3.1(+)/Sjcb2 EcoRI和XhoI双酶切;4：PCR产物

2.3 小鼠荷虫数和抗血吸虫再感染率

Sjcb2免疫组、PZQ处理组及Sjcb2联合PZQ处理组与其它组比较,血吸虫尾蚴再次感染后的小鼠荷虫数均存在显著差异(P＜0.01)。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组分别与其它组比较,抗血吸虫再感染率显著性增高(P＜0.01)。在六组中Sjcb2免疫组抗血吸虫再感染率为最高(表1)。

表1 小鼠荷虫数和抗血吸虫再感染率

2.4 虫卵肉芽肿直径的测量

研究结果表明,与感染攻击组相比,Sjcb2免疫组、PZQ处理组和Sjcb2联合PZQ处理组虫卵肉芽肿直径都显著性减小,而其中Sjcb2联合PZQ处理组虫卵肉芽肿直径减小最明显(表2)。

表2 虫卵肉芽肿直径测量

2.5 14周小鼠肝脏病变检测

Sjcb2免疫组、PZQ处理组和Sjcb2联合PZQ处理组与感染攻击组相比,小鼠肝脏虫卵肉芽肿直径都明显的减小,而其中Sjcb2联合PZQ组虫卵肉芽肿直径减小最明显(图3)。

2.6 血清抗体水平检测

IgG亚型(IgG1,IgG2和IgG3)以及IgE检测结果显示,Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组分别与其它组比较,IgG1水平显著性下降,IgG2水平显著性升高(P＜0.05),见表3。

Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组与其它组比较,抗血吸虫成虫可溶性抗原(soluble adult worm antigen,SWA)特异性IgE水平显著性升高(P＜0.01)。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组与其它组比较,抗Sjcb2特异性IgE水平显著性增加(P＜0.01)。见图4。

图3 小鼠肝脏虫卵肉芽肿HE染色图(×40)

表3 血清抗体水平的检测

图4 血清特异性IgE水平

3 讨 论

宿主感染血吸虫后原发感染继续存在,而对再感染产生不同程度的抵抗力,即伴随免疫(concomitant immunity),这已在国内外的许多研究中得到证实[7-8]。在本实验中Sjcb2组、PZQ处理组及Sjcb2联合PZQ处理组与其它组比较,血吸虫尾蚴再次感染后的小鼠荷虫数均显著性减少。PZQ处理组荷虫数降低是由于PZQ杀死小鼠体内初次感染后的成虫所致;日本血吸虫组织蛋白酶B2是本研究小组首次发现与报道的新基因,基因登陆号为AY225315。Sjcb2定位于血吸虫肠道,可直接破坏宿主红细胞,将宿主红细胞中的血红蛋白降解加以利用,促进虫体的生长发育及雌虫产卵,同时又能刺激机体产生较强免疫应答。本课题前期研究发现：用Sjcb2构建的核酸疫苗具有免疫保护作用,能在一定程度上阻断血吸虫的发育及产卵[9]。Sjcb2免疫组荷虫数降低证实了Sjcb2能刺激机体产生保护性免疫作用,对初次和再次感染的血吸虫有一定抗感染作用;Sjcb2联合PZQ处理组荷虫数显著性下降,可能是联合处理方法中PZQ杀死小鼠体内初次感染后的成虫,而Sjcb2具有免疫保护和抗再感染作用,两者联合进一步降低小鼠体内的荷虫数。

实验结果显示：Sjcb2免疫组抗血吸虫再感染率达70.3%,Sjcb2联合PZQ处理组抗再感染率达61.9%。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组分别与其它组比较,抗血吸虫再感染率显著性增高。研究表明了Sjcb2能刺激机体产生保护性免疫,具有抗血吸虫再感染的能力,使得小鼠抗血吸虫再感染率显著性增高。Sjcb2免疫组与Sjcb2联合组比较,Sjcb2组抗血吸虫再感染率显著性增高,Sjcb2联合组由于经过吡喹酮治疗后,杀死了小鼠体内首次感染的血吸虫,导致小鼠伴随免疫不能建立,小鼠抵抗血吸虫再感染的能力反而下降;而Sjcb2免疫组初次感染血吸虫后,经再次感染可刺激机体产生伴随免疫,Sjcb2抗血吸虫作用和伴随免疫共同作用使得小鼠抗血吸虫再感染能力增强。

Sjcb2免疫组、PZQ处理组和Sjcb2联合PZQ处理组分别与其它各组比较,小鼠肝脏虫卵肉芽肿直径显著性减小,其中Sjcb2联合组虫卵肉芽肿直径减小具有极显著性差异,可能与Sjcb2诱导的保护性免疫反应及抗虫卵发育作用有关,使得虫卵和血吸虫毛蚴更容易遭受宿主的免疫攻击,而PZQ有杀虫作用,减少了虫卵的产生,二者联合能显著性减少血吸虫虫卵引起的免疫病理性反应。

机体体液免疫在抗血吸虫感染中也发挥着重要作用,抗体可通过ADCC和调理作用产生抗虫作用,在抗血吸虫感染中所涉及的抗体主要有IgG[10]和IgE。Hagan[11]在研究中发现,成虫抗原特异性IgE抗体在抗血吸虫再感染时起重要的作用。IgE不仅在血吸虫入侵机体后最初24 h诱导效应细胞及效应分子上起关键作用,而且在针对血吸虫获得性免疫的发展中发挥重要作用[12]。在本实验中,Sjcb2免疫组和Sjcb2联合处理组与其它组比较,抗SWA特异性IgE和抗Sjcb2特异性IgE水平显著性升高,说明了特异性IgE具有抗血吸虫再感染作用,本实验结果与其他学者的相关报道相符。

Dunne[13]研究表明血吸虫抗原特异性IgG4抗体水平升高,可使得人体更容易受到血吸虫的再感染,而人类的IgG4亚型和小鼠的IgG1亚型作用是一致的[14]。抗血吸虫再感染的程度受到IgE的保护,而 IgG4(鼠IgG1)的作用却相反,当低水平的IgE与高水平的IgG4(鼠IgG1)相差100倍以上时,人体更容易受到血吸虫的再感染。因此,认为可将IgG4(鼠IgG1)和IgE两者结合起来,评价它们对血吸虫再感染的抵抗力,根据IgG4(鼠IgG1)和IgE间的平衡情况来预测机体抗血吸虫再感染的能力[15]。研究发现Sjcb2具有降解某些IgG,降低IgG抗体水平的作用[9]。本研究结果显示,Sjcb2免疫组和Sjcb2联合PZQ处理组分别与其它组比较,IgG1亚型水平显著性下降,IgE水平显著性升高,可能与Sjcb2刺激机体产生特异性IgE和选择性降解IgG的作用有关。同时,实验结果显示上述两组小鼠IgG2亚型水平显著性升高,IgG2亚型在血吸虫再感染中起何种作用,是否在抗血吸虫再感染中与IgG1亚型起协调作用,目前国内外未见相关报道,其作用机制尚不清楚。

综上所述,血吸虫组织蛋白酶B2可以促进小鼠IgE水平升高和IgG1水平降低,小鼠抗血吸虫再感染能力增强,使得血吸虫再感染时侵袭能力下降。吡喹酮虽能杀死血吸虫,减少小鼠体内的荷虫数和虫卵肉芽肿,但无抗再感染的作用。Sjcb2联合PZQ在抗血吸虫再感染率方面仅低于Sjcb2,而显著性高于其它各组,且在减少小鼠体内荷虫数、虫卵肉芽肿及肝脏免疫病理反应等方面显著性优于Sjcb2和其它组,两者联合在抗血吸虫病方面具有一定的优势作用,这为防治血吸虫病提供了一个新的思路。

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