池承灯，施清凉，陈紫红，陈继承

（福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）

超声辅助提取禹州漏芦中α-三联噻吩工艺研究

池承灯，施清凉，陈紫红，陈继承*

（福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002）

目的：利用响应面分析法优化超声辅助提取禹州漏芦中α-三联噻吩工艺。方法：以α-三联噻吩提取率为考察指标，选择超声功率、时间和提取温度为随机因子，进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合设计，分析3个因素对响应值的影响。结果：超声辅助提取禹州漏芦中α-三联噻吩的最佳提取功率350W；超声时间42min；超声处理温度41℃。该条件下α-三联噻吩的预测值86.5%，验证值85.1%，理论的相对误差为1.6%。结论：该优化条件可行，为提高禹州漏芦中α-三联噻提取率提供理论依据。

α-三联噻吩，禹州漏芦，提取，超声辅助

禹州漏芦为菊科蓝刺头属植物蓝刺头（Echinops sphaerocephalus L）的干燥根，味苦、性寒，具有清热解毒、舒筋通脉的功效[1]。α-三联噻吩是禹州漏芦中主要活性成分之一，由3个噻吩环通过α-碳原子连接的对称结构[2]，其对微生物、病虫害、人体血红蛋白等具有光促作用[3]。同时，α-三联噻吩在长波紫外光照射下有保肝、抗炎、抗肿瘤、抗HIV[4-7]等作用。深入研究开发禹州漏芦中脂溶性成分，特别是噻吩类物质，是研究热点之一。

目前，α-三联噻吩的研究主要集中在其光敏性和光活化性质，关于提取工艺的研究报道较少。传统的冷浸法[8]、水浴回流提取法[9]提取α-三联噻吩操作较为方便，但提取率较低；超临界CO2萃取技术的应用不会破坏α-三联噻吩有效成分，且能显著提高其提 取 率[10]，但 由 于CO2是 非 极 性 物 质 ，对 极 性 较 强 的物质溶解能力较低，故超临界CO2萃取技术具有一定局限性。超声波辅助提取技术不仅提取率高、速度快，且不改变有效成分的结构[11]。与传统的溶剂提取法相比，超声波辅助提取法不仅能节省能耗，且能有效提高活性成分的提取率。此外，还具有操作简单、有效成分分离简单等特点。因此，本文采用超声波辅助提取法和HPLC分析法结合研究禹州漏芦中α-三联噻吩的提取工艺，在单因素的基础上进行Box-Behnken中心组合设计，响应面法优化禹州漏芦中α-三联噻吩的提取工艺，以期得到最佳的α-三联噻吩提取工艺，为深入开发利用禹州漏芦中α-三联噻吩提供理论性指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

禹州漏芦 河北保定；α-三联噻吩（纯度99%）Sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯、分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；丙酮、三氟乙酸 均为分析纯。

Eppendorf 5415 R台式离心机 德国Ep-pendorf公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津；KQ-500DE双频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；BS210S型电子分析天平 北京赛多利斯仪器有限公司；FW135型中草药粉碎机 天津市泰师特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备和溶剂选择

1.2.1.1 样品制备 将禹州漏芦粉碎，过100目筛，25℃下避光保存备用。

1.2.1.2 溶剂选择 称取1g禹州漏芦粉末于棕色具塞三角瓶，分别以20mL氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和混合提取剂（丙酮和甲醇不同比例混合）作为提取溶剂，超声波辅助提取30min，提取温度40℃，超声功率300W。取2mL于离心管中，10000r/min离心10min，取上清液，0.22μm有机膜滤膜过滤，在相

同色谱条件下进行HPLC检测分析。

1.2.2 色谱条件及标准工作曲线的建立

1.2.2.1 色谱条件 检测波长为350nm；流动相为甲醇∶0.1%三氟乙酸（9∶1，v/v）；流速为0.8mL/min，等梯度洗脱；进样量8μL，柱温为30℃。

1.2.2.2 标准工作曲线的建立 准确称取α-三联噻吩对照品，用丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）溶解，配制成0.5mg/mL的标准溶液储存备用，并稀释成不同的浓度，分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL，根据α-三联噻吩不同浓度与对应的峰面积，绘制标准工作曲线。

1.2.3 α-三联噻吩提取率计算 吸取提取液进行HPLC分析，按下列公式计算α-三联噻吩的提取率：

式中：Y为α-三联噻吩的提取率，%；m为8μL提取液含有α-三联噻吩的质量，μg；V为提取液的体积，mL；M为禹州漏芦样品中α-三联噻吩总量，mg。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 料液比对α-三联噻吩提取率的影响 称取1.5g样品粉末于棕色具塞三角瓶，加入丙酮和甲醇混合提取剂，按不同料液比（1∶3、1∶7、1∶15、1∶20和1∶25g/mL）溶解，超声功率300W，超声时间30min，提取温度为40℃。

1.2.4.2 提取次数对α-三联噻吩提取率的影响 称取1.5g样品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超声功率300W超声时间30min，提取温度为40℃，考察不同超声辅助提取次数（1、2、3、4和5次）的影响。

1.2.4.3 超声功率对α-三联噻吩提取率的影响 称取1.5g样品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超声时间30min，提取温度为40℃，考察不同超声功率（250、300、350、400和450W）的影响。

1.2.4.4 超声时间对α-三联噻吩提取率的影响 称取1.5g样品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超声功率300W，提取温度为40℃。考察不同超声时间（10、20、30、40和50min）的影响。

1.2.4.5 超声温度对α-三联噻吩提取率的影响 称取1.5g样品粉末于棕色具塞三角瓶，20mL丙酮和甲醇混合液溶解，超声功率300W，超声时间30min。考察不同提取温度（30、35、40、45和50℃）的影响。

1.2.5 响应面实验 在单因素实验基础上，选择对α-三联噻吩提取影响比较大的三个因素进行三因素三水平的Box-Behnken的中心组合设计，采用响应面法分析优化α-三联噻吩的超声辅助提取条件，实验设计因子和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

分别以氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和混合提取剂（丙酮和甲醇）作为提取溶剂，超声波辅助提取，HPLC检测分析。结果表明：以石油醚为提取溶剂时样品峰较差且提取率较低；而以氯仿、乙酸乙酯、甲醇和丙酮作为提取溶剂时能较好检测α-三联噻吩。但α-三联噻吩易溶于丙酮、氯仿，微溶于甲醇，若以纯甲醇、氯仿为提取溶剂时提取率较低，以丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）为提取溶剂，α-三联噻吩的提取率显著高于其他溶剂，故本文以丙酮和甲醇混合液（7∶3，v/v）为提取溶剂，能提高禹州漏芦中α-三联噻吩的提取率。

表2 不同溶剂的提取结果Table 2 The extraction resuLts in different solvents

2.2 色谱条件

为了获得较好的分离度，对流动相的溶剂体系进行了优化。经对流动相的组成、配比、流速和柱温等优化，最佳检测条件为：检测波长350nm；流动相为甲醇∶0.1%三氟乙酸（9∶1，v/v）；流速为0.8mL/min，等梯度洗脱；进样量8μL，柱温为30℃。

图1 α-三联噻吩检测的液相图谱Fig.1 The HPLC chromatograms of α-terthienyl

从图1中可以看出，标准品和样品的目标峰峰形良好，检测到α-三联噻吩的保留时间均为8.47min左右，说明该检测方法能有效检测α-三联噻吩。

2.3 标准曲线的绘制

利用外标法，以检测响应值Area（A）为纵坐标、以不同浓度为横坐标绘制标准曲线，得到α-三联噻吩的线性回归曲线为：y=1034314.79x-31367.1（r=0.9999）。由线性相关系数可知，浓度在0.05~0.25mg/mL检测范围内线性良好。

2.4 单因素实验各个因子对提取率的影响

2.4.1 料液比对α-三联噻吩提取率的影响 由图2可知，料液比在1∶3~1∶20段，α-三联噻吩提取率显著提高，而1∶20~1∶25段没有显著性差异。这是由于α-三联噻吩在较小料液比时，提取溶剂中α-三联噻吩浓度较小，而禹州漏芦中α-三联噻吩含量较高，两个体系有较大传质动力，故在1∶3~1∶20段随液料比的减小提取率增大；随着α-三联噻吩提取量的增大，提取率趋于平缓。因此选择合适料液比为1∶20。

图2 料液比对α-三联噻吩提取率的影响Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of α-terthienyl

2.4.2 提取次数对α-三联噻吩提取率的影响 从图3可知，随超声辅助提取α-三联噻吩次数增加，α-三联噻吩的提取率增加，当提取次数达到3次后，α-三联噻吩提取率没有显著性差异。因此，综合经济效益和提取率，最佳提取次数为3次。

2.4.3 超声时间对α-三联噻吩提取率的影响 由图4可知，α-三联噻吩的提取率随时间的增加而增加，差异性显著。当时间大于40min时，α-三联噻吩的提取率开始下降。这可能是由于α-三联噻吩的易挥发性质，随着超声处理时间的增加，α-三联噻吩的挥发量也相应增大[12]。另外，长时间的超声辅助处理可能使α-三联噻吩结构破坏[13]。因此较优超声处理时间为40min。

图4 超声时间对α-三联噻吩提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of α-terthienyl

图5 超声温度对α-三联噻吩提取率的影响Fig.5 Effect of temperature on the yield of α-terthienyl

2.4.4 提取温度对α-三联噻吩提取率的影响 从图5可知，35~40℃段，α-三联噻吩的提取率差异显著，α-三联噻吩的提取率随温度的升高而增大，在40℃达到最大值，40~50℃提取率下降。这可能是由于温度升高促进α-三联噻吩在溶剂中的溶解量，但由于α-三联噻吩具有挥发性，随着温度升高其挥发量也将逐步增加，或是α-三联噻吩在较高温度下分子结构不稳定，发生降解，使得提取率不再增加，甚至减小[12-13]。因此，为获取较高提取率选择提取温度为40℃。

2.4.5 超声功率对α-三联噻吩提取率的影响 由图6可知，超声波功率达到350W前，α-三联噻吩的提取率差异性显著，其随着超声功率的增大而升高。当超声功率大于350W时，α-三联噻吩的提取率开始有下降趋势，这可能是α-三联噻吩的挥发量大于其在溶剂中的溶解量，或是随着超声波功率的增大，α-三联 噻吩 分 子 受 破 坏增 加[13]，故 此α-三联 噻 吩 提 取 率下降。为节省能耗，选择超声波功率为350W。

图6 超声功率对α-三联噻吩提取率的影响Fig.6 Effect of uLtrasonic power on the yield of α-terthienyl

2.5 响应面法优化α-三联噻吩的超声波提取条件

在单因素实验的基础上，以超声功率、超声时间和提取温度为自变量，以α-三联噻吩提取率为响应值，分别以-1、0和1代表对应变量的水平，进行响应面分析实验。实验方案和结果如表3。

表3 Box-Behnken中心组合设计方案及实验结果Table 3 Box-Behnken experiments design and the resuLts of these experiments

利用Design expert 8.0软件对所得数据进行方差分析，分析结果见表4。同时对所得的实验数据进行多元回归拟合，得到α-三联噻吩的提取率（Y）对超声处 理时间（X1）、超声功率（X2）和提取温度（X3）的二次多项回归方程：

表4 回归模型方差分析Table 4 ANOVA for the regression response surface model

由表4的回归模型方差分析结果可知，方程回归高度显著（p＜0.0001）。模型校正系数R2=0.9973和模型修正相关系数Radj=0.9939，且失拟项不显著（p=0.0935＞0.05），表明该模型拟合度高，能较好地描述实验结果，使用该方程代替真实的实验点进行实验分析可行。

图7直观地反映了各因素交互作用的3D响应曲面图和等高线分析图。由等高线分析图可知，存在的极值就是等高线分析图最小椭圆的圆心。结合表4的方差分析结果可知：超声功率、超声时间和提取温度对α-三联噻吩的提取率有极显著影响，在较短时间超声处理、较小超声功率和较低提取温度下α-三联噻吩的提取率较低，随着超声时间、超声功率和提取温度的适当增加可提高α-三联噻吩的提取率。

图7 不同因素交互响应面图和等高线图Fig.7 Responsive surface and contours of different factors

由Design-Expert 8.0软件确立最大响应值（Y）时的编码值X1、X2和X3分别为：X1=0.183、X2=0.248和X3= 0.108。与其对应的α-三联噻吩最佳提取条件为：超声时间41.8min、超声功率362.4W、提取温度40.5℃，理论最佳提取率为86.5%。

2.6 验证实验

考虑实际操作，确定α-三联噻吩的最佳工艺为：超声功率350W，超声时间42min，超声处理温度41℃。在此条件下进行3次平行验证实验，得到三联噻吩的平均提取率为85.1%，与理论预测值相差1.4%，说明响应面法优化的提取工艺是可行的。

3 结论

以氯仿、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和混合提取剂（丙酮和甲醇不同比例混合）作为提取溶剂，对比分析了禹州漏芦中α-三联噻吩提取率差异，结果表明以混合提取溶剂时α-三联噻吩提取率较高，能显著提高α-三联噻吩的提取率。

研究了料液比、超声功率、时间和提取温度等单因素对α-三联噻吩提取率的影响。在单因素基础上采用响应面法优化，得到α-三联噻吩提取工艺的最佳参数组合为：超声功率350W；超声时间42min；提取温度41℃；在该条件下α-三联噻吩的验证值为85.1%，预测值为86.5%，两者拟合度较高。实验结果表明，在该优化工艺条件下能实现较好地对禹州漏芦中α-三联噻吩进行提取，为α-三联噻吩的进一步研究应用奠定了基础。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of α-terthienyl

CHI Cheng-deng，SHI Qing-liang，CHEN Zi-hong，CHEN Ji-cheng*
（College of Food Science，Fujiang Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

Objective：To optimize the ultrasonic-assisted extraction conditions of α-terthienyl in Radix Echinopsis by the response surface analysis methodology.Methods：The yield of α-terthienyl was selected as investigation index，choosing the power of ultrasonic，extraction temperature and extraction time as random factors，and three-factors-three-levels Box-Behnken central composition designed to investigate the effect on the yield of α -terthienyl.Results：The optimal conditions were ultrasonic power of 350W，extraction time of 42min and extraction temperature of 41℃.Under these conditions，the predicted value of 86.5%was inosculated with the actual value of 85.1%.The relative error was only 1.6%.Conclusion：These methods were feasible for optimizing extraction processing and would efficiently improve the extractions of α-terthienyl in Radix Echinopsis.

α-terthienyl；Radix Echinopsis；extraction；ultrasonic-assisted

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.051

2014－02－24

池承灯（1991-），男，大学本科，研究方向：食品科学与工程专业。

* 通讯作者：陈继承（1978-），男，博士，讲师，研究方向：食品分析检测、食品营养及功能性食品开发。