朱亚新，陈朝银，*，赵声兰

（1.昆明理工大学，生命科学与技术学院，云南昆明 650500；2.云南中医学院中药学院，云南昆明 650500）

核桃多酚对酪氨酸酶的作用

朱亚新1，陈朝银1，*，赵声兰2

（1.昆明理工大学，生命科学与技术学院，云南昆明 650500；2.云南中医学院中药学院，云南昆明 650500）

核桃多酚主要含黄酮类和酚酸类化合物，它们不仅能通过干扰酪氨酸酶活性而影响黑色素合成及黄褐斑的形成，也有很好的抗紫外线、抗氧化、清除自由基等功效，是一种很有潜力的天然护肤因子。本文就核桃多酚对酪氨酸酶的作用作一综述，为综合利用核桃资源开发天然植物祛斑产品提供参考。

核桃，多酚，酪氨酸酶

黄褐斑是一种极为广泛的获得性面部色素代谢异常对称性皮肤病，一般对称分布在额部、颧颊部、鼻旁、眼和口唇周围[1]。遗传、内分泌失调、紫外线照射、避孕药、化妆品等是引起黄褐斑的主要因素[2]。现代医学认为黄褐斑主要是由黑色素在皮肤内增多引起的，黑色素细胞增多和黑色素生成增多是黑色素增多的两个主要因素[3]，因而可通过阻断黑色素合成来减少黄褐斑。目前祛斑产品中常添加氧化亚油酸、重金属、防腐剂、香料等，这些物质不仅对皮肤有很强的刺激性，甚至会引起过敏反应[4]。SFDA批准的千白氢醌乳膏，主治黄褐斑、雀斑术后色素沉着，但其主要成分氢醌对皮肤有一定刺激性，长期使用会导致严重的外源性褐黄病[5]。核桃富含多酚化合物，有很好的抗紫外线、抗氧化、清除自由基等功效[6]，有的多酚化合物作为酪氨酸酶的底物类似物与游离酶结合，抑制黑色素生成，祛除黄褐斑，是良好的祛斑化妆品原料[7]。然而，从核桃不同浸提物中分离纯化某些特定结构的多酚难度较大，且得率较低。本文主要阐述核桃相关多酚对酪氨酸酶的作用，以寻求对抑制黑色素生成最有效的核桃多酚，为进一步利用丰富的核桃资源开发新一代天然祛斑产品提供一定参考。

1 黑色素的产生及抑制机理

黑色素是引起黄褐斑的主要原因之一，它由皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生[8]。在黑色素细胞内，酪氨酸在酪氨酸酶作用下逐渐被氧化为多巴和多巴醌，经重排与一系列代谢过程聚合为5，6-二羟基吲哚、吲哚醌，最终形成黑色素[9]。色素沉着及局部皮肤过黑正是由于黑色素分布不均或增长过快造成的[10]。

在产生黑色素的整个反应过程中，酪氨酸酶既可以作为酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶，又可以作为5，6-二羟基吲哚氧化酶，是黑色素形成过程中的主要限速酶[11]，其活性与黄褐斑的形成正相关[12]。通过抑制酪氨酸酶的活性可阻断黑色素合成，从而达到去除黄褐斑的作用。皮肤黑色素的抑制主要包括黑色素细胞的胞内抑制和胞外抑制，对酪氨酸酶的抑制属于胞内抑制，根据抑制机理的不同，又可分为酪氨酸酶的非破坏型抑制和破坏型抑制[13]。前者是通过抑制酪氨酸酶的合成或取代酪氨酸酶的作用底物来阻断黑色素的形成，而后者则由抑制剂直接对酪氨酸酶进行修饰和改性[14]。多酚化合物主要作为酪氨酸酶的底物类似物与游离酶结合，抑制黑色素生成，达到祛斑功效[15]。

2 多酚对酪氨酸酶作用的测定方法

多 酚 化 合 物 对 酪 氨 酸 酶 有 激 活 或 抑 制 作 用[16]，如高良姜总黄酮在一定浓度范围内能够促进酪氨酸酶 活 性 和 黑 色 素 合 成[17]；夏 枯 草 黄 酮 能 很 好 地 增 强酪氨酸酶的疏水性，是酪氨酸酶的竞争型抑制剂[18]；花生红衣总多酚对酪氨酸酶有一定的抑制作用，且最高抑制率可达89.65%[19]。通过对多酚化合物与酪氨酸酶作用的研究，可以找到酪氨酸酶的多酚抑制剂，将它们作为祛斑因子添加于化妆品中可以开发出天然无副作用的祛斑产品。多酚对酪氨酸酶的作用一般可由Lineweaver-Burk双倒数作图法求得酪氨酸酶催化L-DOPA氧化的米氏常数Km和最大速度Vm，并根据曲线判断多酚单体的抑制作用类型，求出多酚单体对酪氨酸酶游离酶的抑制常数（KI）及其对酪氨酸酶与底物络合物的抑制常数（KIS）[16，20]。也可以运用分子模拟软件对抑制剂与酪氨酸酶的相互作用进行分子对接，推断作用机制，并通过分子动力学模拟进行验证以确定抑制作用类型[21]。酶抑制剂的抑制作用类型见表1。

3 核桃相关多酚化合物及其对酪氨酸酶的作用

核桃仁种皮中含有丰富的黄酮类及酚酸类多酚化合物，黄酮类中以芦丁含量最高，酚酸类中则以没食子酸含量最高[22]。万政敏等[23]采用Sephadex-20分离核桃青皮中多酚，并通过HPLC鉴定为没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、芦丁、槲皮素、桑色素；刘传水等[24]通过经典色谱方法对核桃种皮中化合物进行分离并采用光谱分析等方法进行鉴定，确定了化合物为红景天苷、长寿花糖苷、没食子酸等；孟阿会[25]通过高效液相色谱与质谱联用的方法对核桃油进行分析鉴定获得包括槲皮素、没食子酸、咖 啡 酸、鞣花酸等在 内 的11 种 物质 ；Zhang Z等[26]也通过对核桃仁中物质的分离鉴定，检测到了香草酸、邻苯三酚、儿茶素等，见表2。

目前已研究发现对酪氨酸酶有激活作用的核桃相关多酚有酚酸类的绿原酸、阿魏酸、咖啡酸；有抑制作用的有酚酸类的香草酸、没食子酸、对羟基苯甲酸和黄酮类的儿茶素、芦丁、槲皮素、桑色素、鞣花酸、红景天苷等（见表2）；酚酸类的邻苯三酚和黄酮类的长寿花糖苷对酪氨酸酶的作用尚未见报道。

核桃相关多酚单体有很好的抗氧化、抗紫外线、清除自由基、抗衰老、祛斑保湿等作用，能够很好地清除皮肤中的自由基，保护组织免受氧化伤害，防止衰老[33]。多酚单体与蛋白质以疏水键和氢键方式发生复合反应，能使皮肤产生收敛，从而呈现出细腻紧致的状态。此外，多酚作为酪氨酸酶的底物类似物与游离酶结合，抑制黑色素生成，是化妆品中很好的祛斑护肤因子[7]。

4 核桃相关多酚对酪氨酸酶作用机理

通过核桃相关多酚对酪氨酸酶作用机理的研究有利于寻找更为高效的黑色素抑制剂。Xie等[27]研究表明：槲皮素、高良姜精、非瑟酮、3，7，4’-三羟基黄酮和桑色素这些黄酮醇类化合物均是酪氨酸酶的竞争性抑制剂，其中槲皮素的IC50值约为0.05mmol/L，抑 制 常 数（KI）为 0.029mmol/L，桑 色 素 的 IC50值 为0.72mmol/L，KI值为0.41mmol/L。由于槲皮素和桑色素的B环取代基不同，桑色素3-和2’-羟基之间形成的分子内氢键影响了4-羰基和 3-羟基与酶活性中心的铜形成螯合构象，所以桑色素对酪氨酸酶的抑制活性远低于槲皮素。宋康康等[15]通过研究抑制剂对酪氨酸酶的作用，测得对羟基苯甲酸的IC50值为1.30mmol/L，抑制常数（KI）为0.73mmol/L。Peng L H等[34]发 现 红 景 天 苷 对 酪 氨 酸 酶 具 有 抑 制 作 用 ，但 未测定其IC50值和抑制常数（KI）。

Si Y X等[21]应用模拟对接并通过分子动力学模拟进行验证以确定芦丁与酪氨酸酶之间的作用关系，实验测得芦丁对酪氨酸酶抑制的IC50值为6.8mmol/L，且抑制作用表现为竞争型抑制，抑制常数（KI）为1.10mmol/L。邱龙新等[35]采用Lineweaver-Burk双倒数作图法发现没食子酸对酪氨酸酶具有竞争性抑制 作 用 ，且IC50值 为 0.076mmol/L，抑 制 常 数（KI）为0.0868mmol/L。这是由于没食子酸分子中含有与多巴的分子结构相似的多酚基成分，它们与底物竞争酶，导致酶活力下降。Zhang Z等[26]也从核桃仁中分离并检测到具有抗氧化活性的儿茶素。曾亮等[28]采用酶动力学方法研究了儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制效应，测得儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的IC50值约为0.88mmol/L，且抑制作用表现为竞争型抑制，抑制常数（KI）为0.52mmol/L。

表1 酶抑制剂的抑制作用类型Table 1 Types of inhibition by enzymes

表2 核桃多酚单体及其相关生理功能和对酪氨酸酶的抑制作用Table 2 Polyphenols isolated and identified from walnuts and the inhibition to tyrosinase

核桃油具有很好的清除自由基、抗氧化作用，孟阿会[25]通过高效液相色谱与质谱联用的方法从核桃油中检测出一定量的鞣花酸。鞣花酸对酪氨酸酶抑制活性是通过测定酪氨酸酶催化酪氨酸生成的多巴色素的量得到的，因为在475nm波长下多巴色素有最大吸收峰。方燕玉等[29]测得鞣花酸对酪氨酸酶的IC50值为0.165mmol/L。Yoshimasa等[30]发现鞣花酸对酪氨酸酶是非竞争性抑制，其抑制常数（KI）为0.0816mmol/L。鞣花酸能抗氧化、防止黑色素沉着，可制备具有良好保湿性能的化妆品。

此外，有的核桃相关多酚对酪氨酸酶有一定的激活作用。闫军等[31]的研究结果表明，阿魏酸对酪氨酸酶具有反竞争型激活作用，咖啡酸对酪氨酸酶趋于混合型激活作用，而香草酸对酪氨酸酶具有混合型抑制作用，但未给出其抑制作用大小。龚金炎等[35]发现绿原酸对酪氨酸酶具有一定的激活作用。

5 结论与展望

植物多酚具有良好的抗紫外线、抗氧化、清除自由基、祛斑保湿功效，且对皮肤和粘膜无刺激和过敏性反应的特性使其在护肤品领域占有越来越重要的地位[6]。法国兰蔻化妆品推出的复合植物异黄 酮 活 力 系 列 品 牌 产 品 获 得 了 很 好 的 口 碑[36]；瑞 士Cosmetochem AG公司研发的以类黄酮为基本原料的Citrolumine具有祛斑、护肤作用[37]。核桃多酚化合物作为酪氨酸酶的底物类似物与游离酶结合，抑制黑色素生成，祛除黄褐斑，且槲皮素、没食子酸、鞣花酸等在较低浓度下就能对酪氨酸酶产生很好的抑制作用，从而阻断黑色素生成。核桃是世界四大干果之一，目前我国已成为世界第一大核桃生产国[38]，因此利用核桃多酚化合物开发新一代天然祛斑护肤产品，不仅能够达到祛斑保湿效果，而且对皮肤无任何毒副作用，将会赢得更多人的喜爱。

此外，在寻求开发对皮肤作用温和、安全可靠、效果显著的祛斑产品同时，也应当考虑产品本身的经济成本及综合效益。虽然核桃种皮中多酚含量达20%左右[39]，但仍可通过对提取、分离方法的优化进一步提高产率。对黑色素抑制作用明显的核桃多酚单体，可利用有机合成的方法进行人工合成，不仅降低工艺难度，也能减少成本。有些核桃多酚化合物还具有抗菌消毒、抗脂质过氧化、止咳、降血压等功效[23]，可以结合现代生物技术将这些作用最大化，以获得一种具有高综合效用的祛斑产品。

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Effect of polyphenols from walnut on tyrosinase

ZHU Ya-xin1，CHEN Chao-yin1，*，ZHAO Sheng-lan2
（1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Faculty of Chinese Traditional Medicine，Yunnan University of Chinese Traditional Medicine，Kunming 650500，China）

Polyphenols from walnut mainly contain flavonoids and phenolics.As potential natural skin care factors，polyphenols not only could effect melanin synthesis and formation of melasma by interfering in the activity of tyrosinase ，also have good effects on anti ultraviolet radiation ，antioxidant， free radical scavenging and so on.The effects of polyphenols from walnut on tyrosinase was described，so as to provide a reference for comprehensive utilization of walnut resources to develop natural plant freckle products.

walnuts；polyphenols；tyrosinase

TS201.2

A

1002-0306（2014）22-0382-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.075

2014－01－14

朱亚新（1990-），女，硕士研究生，研究方向：生物制药。

* 通讯作者：陈朝银（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物资源高效利用。

云南省科技计划项目（2009EB081，2011AB006）；科技部支撑计划项目（2011BAD46B00）。