曹 勇，马艳梅，商雪娇，吴晓光，*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.黑龙江职业学院，黑龙江双城 150111；3.长春迪瑞医疗科技股份有限公司，吉林长春 130012）

响应面法优化超声辅助醇提黄芪黄酮最佳工艺

曹 勇1，马艳梅2，商雪娇3，吴晓光1，*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.黑龙江职业学院，黑龙江双城 150111；3.长春迪瑞医疗科技股份有限公司，吉林长春 130012）

采用超声辅助醇提法提取黄芪中的黄酮，利用响应面法对黄芪黄酮提取工艺进行优化。在单因素实验基础上，通过响应面法对影响黄芪黄酮提取得率的乙醇浓度、料液比、提取温度、超声时间四个因素进行优化，确定最佳工艺条件为：乙醇浓度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取温度76℃、超声时间30min，黄酮得率为3.30%。

黄芪，黄酮，响应面法，提取工艺

黄芪为豆科植物膜荚黄芪的干燥根，是当前中医临床处方和中成药中用量最大的中药之一，药界素有“十药八芪”之称，也是出口的大宗品种[1]。黄芪的有效成分主要是黄芪多糖、黄芪皂甙和黄酮类，此外还有氨基酸、生物碱、有机酸、硒等化学成分。黄芪中的黄酮或黄酮类似物约二十种左右，大多属于黄酮、异黄酮和异黄烷类化合物。黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基，阻止细胞的退化、衰老，也可以阻止癌症的发生，改善血液循环，降低胆固醇，抑制炎性生物酶的渗出，增进伤口愈合和止痛[2-3]。

黄酮类化合物的提取方法主要有水提法、有机溶剂提取法、超临界萃取、超声波法、微波法等[4-8]。在各 种 提 取 方 法 中 运 用 响 应 面 法（Response Surface Methodology）建立连续变量曲面模型，对实验的各个水平进行分析，确定最佳水平范围，可达到优化提取方法，建立最佳提取工艺的目的[9]。目前，对黄芪中总黄酮的提取工艺研究中超声波辅助醇提取研究较少，研究黄芪中总黄酮最佳提取工艺条件，对于黄芪新药和功能性食品的开发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁（Rutinum）标准品 北京药品生物制品鉴定；内蒙黄芪 购自吉林大药房；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸钠、硝酸铝 等均为分析纯。

高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；SCOUTSCA210型电子天平 梅特勒·托利多常州衡器有限公司；SYC-15B超级恒温水浴锅 南京桑力电子设备厂；KQ5200DB型数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；UV-120型可见分光光度计 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的测定方法 将片状黄芪在60℃下干燥、粉碎后，过30目筛。精密称取10.0000g置于具塞锥形瓶中，加入实验条件设定的乙醇量，密塞，在一定温度水浴中超声提取一定时间，放冷，过滤。总黄酮的测定采用分光光度法，样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[10]处理，于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行定量。

1.2.2 芦丁标准曲线的制备 准确称取芦丁标准品20mg，置100mL量瓶中，60%乙醇溶液定容至100mL，得到0.2mg/mL的芦丁标准液。

精 密 吸 取0.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL 芦丁标准液，加入60%乙醇4mL，5%的亚硝酸钠0.4mL，摇匀静置6min，加入10%的硝酸铝0.4mL，摇匀静置6min，加入4%的氢氧化钠4mL，用60%的乙醇定容至25mL，摇匀静置25min。在510nm条件下测其吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.0124x+0.0086，相关系数R2= 0.9991，结果表明吸光度与质量浓度线性关系良好。取适量样品溶液按标准曲线制作方法测定吸光度，通过标准曲线计算样品中黄酮含量。

式中，C为由标准曲线计算样品浓度（mg/mL）；M为原料干重（mg）；V1为取样体积（mL）；V2为测试用样品体积（mL）。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 乙醇浓度的确定 准确称取黄芪粉末10.00g，按 料 液 比1∶20（g∶mL）加 入 乙 醇 浓 度 分 别 为 40% 、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液，70℃超声提取30min。

1.2.3.2 料液比的确定 准确称取黄芪粉末10.00g，按料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）加入60%乙醇水溶液，70℃超声提取30min。

1.2.3.3 提取温度的确定 准确称取黄芪粉末10.00g，按料液比1∶20（g∶mL）加入60%乙醇水溶液，分别在40、50、60、70℃、80℃水浴中超声提取30min。

1.2.3.4 超声时间的确定 准确称取黄芪粉末10.00g，按料液比1∶20、提取温度70℃、超声提取时间分别为10、20、30、40、50min。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验基础上，利用Design-Expert 8.0.7.1软件进行响应面设计。实验方案及结果见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and coded levels of response surface analysis

1.3 数据处理

用Design-Expert 8.0.7.1 软 件 程 序 ，根 据 Box-Behnken实验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法，以总黄酮得率为响应值对提取条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及分析

2.1.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响 由图1可知，黄酮的得率随乙醇浓度的增加呈先增大而后降低的趋势。当浓度达到60%时，黄酮得率为2.68%，达到最大。当乙醇浓度再增加时，得率略有下降，这是由于黄酮类化合物是一大类极性范围很广的物质，一定量乙醇的加入使醇溶性和水溶性的总黄酮都能最大程度的溶出，当溶液的极性过高和过低时，都会降低黄酮类化合物的溶出，导致总黄酮的提取率下降。故本实验选择最佳乙醇浓度为60%。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 Ethanol concentration effect on the yield of flavonoids

2.1.2 料液比对黄酮得率的影响 由图2可以看出，料液比太小，不能保证原料中的黄酮全部转移到液相中，提取得率较低；黄酮得率随料液比增加而增大，料液比为1∶20（g∶mL）时的黄酮得率为2.55%。当料液比大于1∶20（g∶mL）后，黄酮得率增加不明显。故选择最佳料液比1∶20（g∶mL）。

图2 料液比对黄酮得率的影响Fig.2 Material liquid ratio on the yield of flavonoids

2.1.3 提取温度对黄酮得率的影响 温度的升高使分子扩散运动加快，有助于溶质的扩散和溶剂的渗透，有利于黄芪黄酮物质的溶出。由图3可以看出，提取温度低于70℃时，随提取温度的升高，黄酮得率较快增大，可达到70℃时2.75%。而温度过高，其中的活性成分易受到破坏，杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，成本费用增大，综合考虑，选择最佳提取温度为70℃。

图3 温度对黄酮得率的影响Fig.3 Temperature effect on the yield of flavonoids

2.1.4 超声时间对黄酮得率的影响 提取的传质过程需要一定时间才能达到平衡，超声波可以加快传质过程，时间太短，还未达到平衡，其得率就偏低；当传质过程达到基本平衡后，得率就不会明显上升。由图4可知，黄芪黄酮得率随超声时间的延长而增大，提取时间30min时，黄酮得率达到最大值，30min后基本达到平衡。从时间效益考虑，选择最佳超声时间30min。

图4 超声时间对黄酮得率的影响Fig.4 Ultrasonic effect on the yield of flavonoids from time

2.2 响应面优化实验分析

按表1进行响应面实验，共27个实验点，其中1~ 24号为析因实验，25~27为中心实验。实验方案及结果见表2。对实验结果回归拟合，得该模型对应的回归方程为：

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

由Design-Expert 8.0.7.1软件对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，二项式拟合模型方程失拟性（p＞0.05），符合模型要求，回归模型达到极显著水平（p＜0.01），说明该方程拟合度良好，可利用该模型分析最佳提取工艺条件。由表3中F值的大小可以判断各因素对类黄酮提取率影响的强弱。F值越大，影响作用越强。各个因素对类黄酮提取率影响的程度大小的次序为提取温度＞超声时间＞料液比＞乙醇浓度，其中提取温度对总黄酮提取率的影响达到极显著水平（p＜0.0001）。

2.3 响应曲面分析

为了考察交互项对多糖得率的影响，在两个因素固定不变的情况下，对模型进行降维分析，经Design-Expert 8.0.7.1软件处理得到响应面及等高线。根据所得模型经响应面回归分析，得出最佳提取条件为：乙醇 浓 度 58.97% 、料 液 比 1 ∶18.97（g ∶mL）、提 取 温 度76.11℃、超声时间27.08min，此时黄酮得率为3.35%。考虑到实际操作的可靠性，将实验结果进行修正，即乙醇浓度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取温度76℃、超声时间30min，此条件下黄酮得率可达到3.30%。

3 结论

在单因素基础上，通过Box-Behnken实验，建立回归方程，经响应面回归分析得到优化组合条件为：即乙醇浓度60%、料液比1∶20（g∶mL）、提取温度76℃、超声时间30min，此条件下黄酮得率可达到3.30%。

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Optimization of ultrasonic assisted alcohol extraction process of flavonoids from Radix Astragali by response surface methodology

CAO-Yong1，MA Yan-mei2，SHANG Xue-jiao3，WU Xiao-guang1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Heilongjiang Vocational College，Shuangcheng 150111，China；3.Changchun DIRUI Medical Technology Co.，Ltd.，Changchun 130012，China）

Response surface methodology was used to optimaize the ultrasonic assisted alcohol extraction of flavonoids from Radix Astragali.On basis of single factor experiment，optimize the ethanol concentration，solidliquid ratio，extraction temperature，and ultrasonic time which influence the yield of flavonoids.The optimum technological conditions were determined as follows ：the ethanol concentration 60% ，solid-liquid ratio 1 ∶20（g∶mL），extraction temperature 76℃，ultrasonic time 30min，and the flavonoids yield was 3.30%.

Radix Astragali；flavonoids；response surface methodology；extraction process

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0278-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.052

2014－04－11

曹勇（1976-），女，博士，讲师，主要从事食品分析及功能性食品方面的研究。

* 通讯作者：吴晓光（1973-），女，硕士研究生，副教授，主要从事动物性食品加工方面的研究。