谢凤英，张秀玲，程 雪，校颜玲，李赛男

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

荞麦米多酚物质的提取及其抗氧化特性

谢凤英，张秀玲*，程 雪，校颜玲，李赛男

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

为了获得乙醇提取荞麦米多酚物质的最佳工艺参数，以提取温度、时间、乙醇浓度及料液比为实验因子，以多酚物质得率为响应值，采用响应面设计进行实验。并对优化后荞麦米提取物粉末的抗氧化特性进行了分析。结果表明，影响荞麦米多酚物质得率因素强弱顺序依次为：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间，荞麦米多酚物质提取最优条件为提取温度56℃、提取时间6.0h、料液比1∶12g/mL、乙醇浓度65%。2mg/mL荞麦提取物对羟自由基在反应时间为20min时具最强清除活性，其清除率为26.88%；对DPPH·的清除在反应时间为30min时，清除率最高，为43.65%；在反应时间为10min时，3mg/mL荞麦提取物表现出最大的还原力，其值为2065.39。

荞麦米，多酚，提取，响应面，抗氧化

现代医学研究表明，氧化损伤是导致许多慢性病，如心血管病、癌症和衰老性疾病的重要原因，多酚物质的抗氧化功能可以对这些慢性病起到预防作用[1]。荞麦作为杂粮作物之一，已被证明具有抗氧化活性[2-4]，其含有的黄酮醇苷分别为芦丁、槲皮素、山奈酚-3-芸香糖苷和黄烷醇[5]。与大多数水果、蔬菜和粮食作物相比，荞麦中含有较多的芸香苷，其中槲皮素-3-芸香糖苷具有抗氧化、抗炎和抗癌作用并且还可以降低与人血管的脆性有关的出血疾病和高血压[6-7]。随着研究的深入，荞麦多酚的抗感染、抗突变、抗肿瘤等作用也被人们所认知。因此，荞麦抗氧化功能越来越受到人们的重视，并成为了研究的热点[8-9]，但以往的研究多以荞麦为研究对象，而未对荞麦可食部分-荞麦米中的多酚物质含量和抗氧化特性展开专门研究。因此，本实验通过对荞麦米中多酚物质提取条件及其抗氧化特性的研究，以期为荞麦米抗氧化保健功能食品的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荞麦米 辽宁省阜新化石戈谷业有限责任公司提供，粉碎后60目过筛，低温冰箱保存备用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚试剂 Sigma公司进口分装；没食子酸、碳酸钠、30%过氧化氢、硫酸亚铁、无水乙醇 均为国产分析纯。

高速万能粉碎机 兴市科宏仪器有限公司；DF-101S集热式磁力加热搅拌器金坛市医疗仪器厂；SC-3614低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；722S可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；旋转蒸发仪R-1005 郑州长城科工贸有限公司；电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；酸度计 杭州奥立龙仪器有限公司；数显恒温水浴锅 金坛市双捷实验仪器厂。

1.2.1 荞麦米多酚物质乙醇提取 准确称取10.0g荞麦米粉于烧杯中，按照工艺优化实验设计的因素水平条件进行乙醇提取。提取后4000r/min离心15min取上清液，于旋转蒸发仪上真空浓缩后，定容至25mL，即为荞麦米多酚物质的提取液。

1.2.2 多酚物质含量测定 采用Folin-ciocalteu法[10]，以没食子酸作为标准物。

1.2.3 多酚物质得率的计算 多酚物质提取效果以得率为考察指标，得率为提取液中多酚物质的质量与物料质量之比，计算公式如下：

式中：Y—多酚物质得率，%；m—提取液中多酚物质的质量，g；M—干物料的质量，g。

1.2.4 荞麦米提取物抗氧化特性 按照优化后的最佳工艺条件提取荞麦米中多酚物质，并将其减压浓缩后，冻干，得荞麦米提取物粉末[11]。通过测定不同浓度荞麦米提取液对羟自由基、DPPH自由基及还原力随时间的变化情况来确定荞麦米多酚提取物的抗氧化特性。

1.2.4.1 羟 基 自 由 基（·OH）的 清 除 作 用 参 考SmimoffN和Cumbes[12]的方法。取若干10mL试管，依次加入8.0mmoL/L FeSO4溶液0.6mL，0.02moL/L H2O2溶液 0.5mL及 样 品 溶 液 后 加 入 3.0mmoL/L 水 杨 酸 溶液2.0mL，于 37℃ 保 温 30min，加 去 离 子 水 至 刻 度 ，4000r/min的转 速 下离 心10mim，于510nm处 测 定 吸光值。以多酚提取物抑制·OH引发的水杨酸羟基化作用的程度表示其清除·OH的能力。计算公式如下：

应用R软件对数据进行统计分析，利用x2检验、Logistic回归和非参数Kruskal-Wallis检验对不同种类酱油、不同采样地点、不同生产季度等的污染情况进行比较，以α=0.05为检验水准。

式中：A0—未加清除剂（多酚提取物）的吸光值，A1—加入清除剂的吸光值，A2—试剂空白（未加水杨酸）的吸光值。

1.2.4.2 DPPH自由基（DPPH·）的清除作用 参照Sahreen等[13]的方法进行。20mg DPPH·溶于100mL甲醇中得DPPH·储液。甲醇稀释DPPH·储液至517nm下吸光值为0.870±0.02得DPPH工作液。3mL DPPH·工作液与100μL样品液反应30min，517nm处测定吸光值，3mL DPPH工作液与100μL甲醇反应作对照。样品对DPPH·的清除率按下面的公式计算：

式中：A0—3mL DPPH溶液与100μL甲醇反应的吸光值，A1—3mL DPPH溶液与100μL样品反应的吸光值。

1.2.4.3 还 原 力 的 测 定 参 照 Thiansilakul等[14]的 方法进行。取0.2mL样品液于离心管中，分别加入2mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH6.6）和1%铁氰化钾溶液2mL，混匀，于50℃反应20min，迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2mL终止反应，转速4000r/min下离心10min。取上清液2mL，加入2mL蒸馏水，再加入0.5mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，于暗处反应10min，700nm处测定吸光值。计算公式如下：

式中：A1—样品与各试剂反应的吸光值，A0—试剂空白的吸光值。

1.2.5 实验设计 通过单因素预实验可知，随着温度的升高，荞麦多酚物质得率逐渐增加，当温度达到55℃时多酚得率达到最高值0.32%。其后随着温度的提高，其多酚物质得率降低；多酚物质得率在提取时间为6.0h时达到最高值0.39%；当料液比为1∶12g/mL时，多酚物质得率达到最高值0.38%，其后多酚物质得率趋于稳定；乙醇溶液浓度的增加，荞麦多酚得率不断增加，当乙醇浓度达到70%时，荞麦多酚得率最高为0.27%。因此，在实验选择的条件下，响应曲面设计时零水平分别为提取温度55℃、提取时间6.0h、料液比1∶12和乙醇浓度70%。

在单因素实验基础之上，选取提取温度、提取时间、料液比和乙醇浓度为4个影响因素，以多酚物质得率为响应值，根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[15]，设计四因素三水平实验，其因素水平表见表1。

表1 Box-Benhnken设计实验因素水平及编码Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.3 数据处理

每个结果重复处理3次，所测数值均以平均值表示，采用Design Expert7.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 模型建立

Box-Benhnken实验设计及结果如表2所示。利用Design Expert对表2中的实验数据进行二次多项回归拟合，获得多酚物质得率Y对提取温度X1、提取时间X2、料液比X3和乙醇浓度X4的多元回归方程：

多酚物质得率二次回归方程方差分析结果见表3。由表3中的方差分析结果表明，方程具有极显著性（p＜0.0001），其决定系数R2为0.9176。逐项显著性检验结果表明，一次项、交互项、二次项中除了交互项X1X3和X1X4外，其余项均达到显著性水平，模型失拟p=0.8790＞0.05，不显著，说明该二次模型能够拟合真实的实验结果。

2.2 多酚物质得率的响应曲面分析与优化

利用Design Expert对表2中的实验数据进行二次多项回归拟合，所得到的二次回归方程的响应曲面和等高线图如图1~图6所示。

表2 Box-Benhnken设计表及实验结果Table 2 Box-Benhnken design matrix and experimental results

由图1可知，当乙醇浓度为70%，料液比为1∶12时，提取温度不变，随着提取时间的延长，多酚物质的得率先增加，当时间达到一定值后，趋于稳定。当提取时间恒定，提取温度在50~60℃范围内，多酚物质的得率先增加，达到极大值，随后缓慢下降。

图1 提取温度和提取时间对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.1 The 3-D surface plot of extraction temperature and time interaction on yield of total polyphenols

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental result

由图2可知，当乙醇浓度为70%、提取时间为6h时，提取温度不变，随着料液比的增加，多酚物质的得率先增加后降低。当料液比恒定，多酚物质的得率随提取温度的变化是先增加，达到极大值，随后缓慢下降。

图2 提取温度和料液比对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.2 The 3-D surface plot of extraction temperature and sample-to-solvent ratio interaction on yield of total polyphenols

由图3可知，当料液比为1∶12、提取时间为6h时，提取温度不变，随着乙醇浓度的增加，多酚物质的得率先增加，当乙醇浓度达到一定值后，趋于稳定并略有下降。当乙醇浓度恒定，多酚物质的得率随提取温度的变化是先增加，达到极大值，随后缓慢下降。

由图4可知，当乙醇浓度为70%、提取温度为55℃时，提取时间较小时，随着料液比的增加，多酚物质的得率逐渐减小；当提取时间较长时，随料液比增加，多酚物质得率先增后趋于稳定。当料液比恒定，多酚物质的得率随提取时间的延长是先增加，达到极大值，随后趋于平衡。

图3 提取温度和乙醇浓度对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.3 The 3-D surface plot of extraction temperature and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

图4 提取时间和料液比对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.4 The 3-D surface plot of extraction time and sample-tosolvent ratio interaction on yield of total polyphenols

由图5可知，当料液比为1∶12、提取温度为55℃时，提取时间不变，随着乙醇浓度的提高，多酚物质的得率先略有增加后降低。当乙醇浓度一定，多酚物质的得率随提取时间的延长是先小幅增加，达到极大值后降低。

图5 提取时间和乙醇浓度对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.5 The 3-D surface plot of extraction time and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

由图6可知，当提取时间为6h、提取温度为55℃时，料液比不变，随着乙醇浓度的提高，多酚物质的得率降低。当乙醇浓度一定，多酚物质的得率随料液比的增加，先增加达到极大值后逐渐下降。

由回归方程、各实验因素对多酚物质得率的相应曲面及方差分析可知，提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度对多酚物质得率的线性效应及曲面效应皆显著（p＜0.05）；线性效应中影响多酚物质得率的强弱顺序为：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间；提取温度和时间、提取时间和料液比、提取时间和乙醇浓度、料液比和乙醇浓度对多酚物质得率的交互作用显著。

图6 料液比和乙醇浓度对多酚物质得率交互影响的曲面图Fig.6 The 3-D surface plot and sample-to-solvent ratio and ethanol concentration interaction on yield of total polyphenols

图7 荞麦米提取物对羟自由基清除能力Fig.7 Hydroxide radical scavenging activity of buckwheat extraction

2.3 荞麦米多酚最适提取工艺参数的确定及验证

通过对拟合二次回归方程求偏导并令其等于零，求得荞麦多酚类物质提取最优条件为：提取温度（X1）55.65℃ 、提 取 时 间（X2）6.02h、料 液 比（X3）1 ∶12g/mL、乙 醇 浓 度（X4）65.06%，此 时 多 酚 物 质 得 率 为0.46%。考虑到实际操作性，校正理论数据为：提取温度（X1）56℃ 、提 取 时 间（X2）6.0h、料 液 比（X3）1 ∶12g/mL、乙 醇浓度（X4）65%，三次验证实验得多酚物质得率为0.48%，与预测值相差3.48%。误差率在合理的范围之内，说明该响应曲面优化得到最佳工艺条件参数是可靠的。

2.4 抗氧化特性的测定结果

2.4.1 对·OH的清除作用 荞麦米提取物对·OH清除作用结果见图7。由图7可以看出，三种不同浓度的荞麦提取物对·OH清除作用随时间的变化规律是：1mg/mL和2mg/mL荞麦提取物对·OH清除率随时间的延长而增加，在20min时清除率达到最大，分别为21.27%和26.88%，其后随着时间的延长而降低并趋于平稳。3mg/mL荞麦提取物对·OH清除率在10min处达到最大值24.58%后随时间的延长先降低后又有所增加。从中可以看出，在Fenton反应中H2O2与二价铁离子混合后产生·OH在30min左右完成，在这段时间内，3mg/mL荞麦提取物由于其浓度高，因而对·OH的清除作用发生前置现象。而在30min之后，对·OH的清除作用只与荞麦提取物的浓度呈正相关性。

2.4.2 对DPPH·的清除作用 荞麦米提取物对DPPH·的清除作用结果见图8。由图8可以看出，三种不同浓度的荞麦提取物对DPPH·的清除能力随着时间的延长而逐渐增加，在30min达到最高后降低，而后又在60min处达到另一极大值。但其也存在着差异，30min时，三个浓度中2mg/mL清除率最大为43.65%，但在60min时3mg/mL清除率最大为43.67%。这一测定结果与Zhang和Tong[16]发现的自由基反应达到稳定状态的时间与抗氧化剂和DPPH·的浓度比不成线性关系的观点相一致。

图8 荞麦米提取物对DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging activity of buckwheat extraction

2.4.3 还原力的测定 还原力的测定结果见图9。从图9中可以看出，浓度为1mg/mL、2mg/mL和3mg/mL荞麦米提取物还原力随着时间的变化情况为：反应时间为10min时，其都表现出最大的还原力，依次为817.3、1396.2和2065.39，其后，随着时间的延长，三种不同浓度的荞麦提取物的总还原力全部降低。由此可见，作用一定时间后，荞麦提取物浓度越高，还原能力越强，其抗氧化活性越大[17]。

图9 荞麦米提取物还原能力Fig.9 Reducing power of buckwheat extraction

3 结论

3.1 利用响应面法优化并建立了荞麦米多酚物质提取最佳工艺条件为：提取温度56℃、提取时间6.0h、料液比1∶12g/mL、乙醇浓度65%，此时荞麦多酚物质得率为0.48%，实验结果重复性较好。

3.2 荞麦米多酚物质体外抗氧化活性实验结果表明：2mg/mL荞麦提取物对·OH在作用时间20min时表现出26.88%最大清除率，对DPPH·的清除在作用时间30min时清除率最大为43.65%；3mg/mL荞麦提取物作用时间10min时表现出2065.39最大的还原力。

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Polyphenol extraction from buckwheat and its antioxidant activities

XIE Feng-ying，ZHANG Xiu-ling*，CHENG Xue，JIAO Yan-ling，LI Sai-nan
（School of Food College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

To obtain the optimum parameter of polyphenol extraction from buckwheat，this paper took extracting temperature，time ，ethanol concentration and sample-to-solvent ratio as single factor，and the yield of total polyphenol as response value，applied response surface methodology trial to experiment.And the antioxidant activities of the optimized buckwheat extraction were analyzed.Results showed that the orders of each factor influenced the buckwheat polyphenol yield were as follows：sample-to-solvent ratio ＞ethanol concentration ＞extract temperature ＞extract time，and the optimized conditions were temperature 56℃ ，time 6.0h，sample-tosolvent ratio 1 ∶12g/mL，ethanol concentration 65%.The antioxidant activities of extracts obtained at optimal conditions were as follows：2mg/mL buckwheat extraction had the maximum capacity of scavenging of hydroxide radical at 20min ，the value was 26.88% ，and also had the maximum capacity of scavenging of DPPH· at 30min，the value was 43.65%.3mg/mL buckwheat extracts showed the maximum capacity of reducing power at 10min，the value was 2065.39.

buckwheat；polyphenol；extraction；response surface methodology；antioxidant

TS210.4

B

1002-0306（2014）22-0259-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.048

2014－02－25

谢凤英（1975-），女，博士，讲师，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白质工程。

* 通讯作者：张秀玲（1968-），女，教授，研究方向：农产品贮藏加工。