张春岭，吴校卫，2，陈大磊，刘杰超，焦中高，*

（1.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州 450009；2.河南省三门峡中等专业学校，河南三门峡 472000）

硒化红枣多糖制备工艺优化

张春岭1，吴校卫1，2，陈大磊1，刘杰超1，焦中高1，*

（1.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州 450009；2.河南省三门峡中等专业学校，河南三门峡 472000）

在硝酸催化下，以亚硒酸钠为硒化剂合成硒化红枣多糖，并以硒含量为考察指标，采用正交设计方法优化了硒化红枣多糖合成工艺。结果表明，硝酸浓度对红枣多糖硒化修饰的影响最大，其次是反应温度，反应时间的影响最小，其最佳工艺条件为：硝酸浓度0.6%、反应温度65℃、反应时间24h，在此条件下制备得到的硒化红枣多糖中硒含量可以达到96.98mg/g。紫外光谱和红外光谱分析表明，红枣多糖与亚硒酸基形成了稳定的亚硒酸酯化合物。

红枣，硒化多糖，制备

硒是人体必需的微量元素，在体内具有抗氧化、提高免疫力、防癌抗癌、防衰老和防止心血管疾病发生等多种生理功能[1-2]。但硒在人体内的营养剂量和毒性剂量界限非常接近，使用无机硒作为补硒剂常常会面临硒中毒的危险。与无机硒相比，有机硒具有生物利用度和活性高、毒性低等特点，因此常被作为高安全性和高生物活性的补硒剂来使用[1]。常见的有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖是硒与活性多糖键合的化合物，不但具有微量元素硒的多种生理功能，而且还具有多糖的各种活性与功效，能够充分发挥硒和多糖的双重生理功效，使两者的作用相互协调并得到增强，毒副作用降低[3-8]，因而备受国内外研究者的关注。由于天然存在的硒多糖含量极微，使得硒多糖的开发利用受到了一定限制，因而国内外众多研究者着手对天然多糖进行硒化修饰，人工合成各种硒多糖，如硒化海藻多糖[9-10]、硒化大蒜多糖[8]、百合多糖硒酸酯[11]、硒化枸杞多糖[12]、款冬花硒多糖[6]、硒化黄芪多糖[13]、硒化灵芝多糖[14]、硒化红薯叶多糖[15]、红景天多糖硒[16]、刺槐豆多糖硒酸酯[17]、刺梧桐多糖[18]等。这些人工合成的硒多糖兼具硒和原多糖的双重生理功效，更易于被机体吸收和利用，因此能够更好地发挥硒和多糖的生理活性。

多糖是红枣中最重要的活性成分之一，已被证实具有清除体内的活性氧[19-20]、改善小鼠造血功能[21]、提高机体免疫力[22]、抗疲劳[23]等多种生物活性，对其进行硒化修饰可能获得具有多重生理功效的高活性有机硒多糖化合物。目前，人工合成硒化多糖的方法主要有SeOCl2法、接枝法和亚硒酸（钠）法等[24]。其中，亚硒酸（钠）法由于试剂简单易得、反应条件温和、安全 性 高 而 最 为 常 用 ，已 在 百 合 多 糖[11]、硒 化 枸 杞 多糖[12]、款冬花硒多糖[6]、红景天多糖硒[16]、刺槐豆多糖硒酸酯[17]、刺梧桐多糖[18]等的硒化修饰中得到了广泛的应用。因此，本文以亚硒酸钠为硒化剂合成硒化红枣多糖，采用正交设计方法优化硒化红枣多糖合成工艺，从而为进一步改善红枣多糖生物活性、拓宽红枣多糖的应用途径和开发新型多功能有机硒多糖化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣（新郑灰枣） 由河南新郑市枣树科学研究所提供；亚硒酸钠 上海新宝精细化工厂；吡啶 青岛市丰乐化工有限公司；硝酸、无水乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、硒粉、苯酚、浓硫酸 天津市科密欧化学试剂有限公司。

SPECORD 50型 紫 外/可 见 分 光 光 度 计 德 国Analytik Jena AG公司；Nicolet 6700红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；Re52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LGJ-12-50小型冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；BS214D电子天平 德国赛多利斯公司；78HW-1恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DZKW型电子恒温水浴锅 北京市光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 红枣多糖的制备 红枣去核、粉碎后，经60℃热水浸提2次，合并提取液，离心（4000r/min，30min）除去杂质，上清液用旋转蒸发器低温浓缩，然后加入4倍体积的乙醇沉析，沉淀用少量蒸馏水复溶，Sveag法脱蛋白，大孔树脂脱色，对蒸馏水透析72h，真空浓缩后重新加入4倍体积的乙醇沉析，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，经索氏抽提法脱脂后真空干燥，得到红枣多糖提取物。应用苯酚-硫酸法测定其多糖含量为71.2%。

1.2.2 硒化红枣多糖的制备 取1.0g红枣多糖提取物溶于100mL适宜浓度的硝酸溶液中，加入10mL吡啶和1.6g亚硒酸钠，在一定温度条件下搅拌反应。反应结束后减压浓缩至20~30mL，然后加入3倍体积的无水乙醇，混匀后置于-4℃条件下静置过夜，使其充分沉淀，离心（4000r/min，30min）分离沉淀，用少量水溶解后用蒸馏水透析72h，未透过液经低温减压浓缩、冷冻干燥得硒化红枣多糖。

1.2.3 硝酸浓度对红枣多糖硒化修饰的影响 按照1.2.2的方法，固定反应温度60℃、反应时间24h，改变硝酸浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，制备硒化红枣多糖并测定硒含量，研究硝酸浓度对红枣多糖的硒化修饰的影响。

1.2.4 反应时间对红枣多糖硒化修饰的影响 按照1.2.2的方法，固定反应温度60℃、硝酸浓度0.6%，改变反应时间分别为12、24、36、48、60h，制备硒化红枣多糖并测定硒含量，研究反应时间对红枣多糖的硒化修饰的影响。

1.2.5 反应温度对红枣多糖硒化修饰的影响 按照1.2.2的方法，固定硝酸浓度0.6%、反应时间24h，改变反应温度分别为40、50、60、70、80℃，制备硒化红枣多糖并测定硒含量，研究反应温度对红枣多糖的硒化修饰的影响。

1.2.6 硒化红枣多糖的制备工艺正交实验 在单因素实验的基础上，采用正交实验法优化硒化红枣多糖制备的工艺条件。按照硝酸浓度、反应温度、反应时间做三因素三水平正交实验，正交实验因素及水平表见表1。

表1 硒化红枣多糖制备工艺正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design for the preparation of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

1.2.7 硒化红枣多糖中硒含量测定 参照梁淑轩等[12]的方法对硒化红枣多糖样品用浓硝酸消化完全后采用分光光度法测定其中的硒含量。

1.2.8 硒化前后红枣多糖的紫外光谱分析 配制0.01%的红枣多糖、硒化红枣多糖及亚硒酸钠水溶液，以蒸馏水为空白，于190~400nm范围内进行扫描测定。

1.2.9 硒化前后红枣多糖的红外光谱分析 干燥的硒化红枣多糖或原红枣多糖6mg与100mg KBr混合研磨后压片，于Nicolet 6700红外光谱仪采用DTGS检测器在4000～400cm-1范围内进行扫描测定。

2 结果与分析

图1 硝酸浓度对对红枣多糖的硒化修饰的影响Fig.1 Effect of concentration of nitric acid on selenylation of polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

2.1 硝酸浓度对红枣多糖的硒化修饰的影响

不同浓度硝酸对红枣多糖的硒化修饰的影响如图1所示。由图1可以看出，在反应温度60℃、反应时间24h的条件下，当硝酸浓度低于0.6%时，制备得到的硒化红枣多糖中的硒含量随着硝酸浓度的提高而升高，但当硝酸浓度超过0.6%时，制备得到的硒化红枣多糖中的硒含量则急剧下降。硝酸属于强酸，酸度过高易造成红枣多糖的降解，不利于硒化反应的进行，而硝酸浓度过低又起不到最佳的催化作用，因此硝酸浓度过高或过低都不利于硒化反应的进行，硝酸浓度为0.6%左右时比较适宜于硒化红枣多糖的制备。

2.2 反应时间对红枣多糖的硒化修饰的影响

图2所示为不同反应时间对红枣多糖的硒化修饰的影响。由图2可以看出，在反应温度60℃、硝酸浓度0.6%条件下，随着反应时间的增加，制备得到的硒化红枣多糖中的硒含量先增加后减小，在反应时间24h时制得的硒化红枣多糖中的硒含量最高，36~48h时略有降低，超过48h则大幅下降。反应时间过短，反应不充分，导致硒不能与红枣多糖有效结合；反应时间过长，红枣多糖在高温、强酸性条件下降解严重，也会影响硒化反应进行。因此，确定红枣多糖的硒化反应时间为24h。

图2 反应时间对红枣多糖的硒化修饰的影响Fig.2 Effect of reaction time on selenylation of polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

2.3 反应温度对红枣多糖的硒化修饰的影响

在硝酸浓度0.6%、反应时间24h的条件下，不同反应温度对红枣多糖的硒化修饰的影响见图3。由图3可以看出，当温度在60℃以下时，随着反应温度的升高，制备得到的硒化红枣多糖中硒含量大幅升高，但当反应温度从60℃升至70℃时，制备得到的硒化红枣多糖中的硒含量却略有下降，但与反应温度为60℃时的差异并不显著，进一步提高反应温度至80℃时，硒含量则大幅降低。这可能是由于红枣多糖在高温的强酸性条件下发生了降解，影响硒化反应的进行，因此红枣多糖的硒化修饰宜在60~70℃的温度条件下进行。

2.4 硒化红枣多糖制备工艺正交实验结果

为进一步优化硒化红枣多糖制备工艺条件，按照硝酸浓度（A）、反应温度（B）、反应时间（C）为三个实验因子，以制备得到的硒化红枣多糖中的硒含量为考察指标，进行三因素三水平正交实验，结果见表2。

图3 反应温度对红枣多糖的硒化修饰的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on selenylation of polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

表2 硒化红枣多糖制备工艺正交实验结果及分析Table 2 Orthogonal test results and analysis for the preparation of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

由表2可以看出，影响红枣多糖硒化反应因素的主次顺序为A＞B＞C，即硝酸浓度对红枣多糖硒化修饰的影响最大，其次是反应温度，反应时间的影响最小。最佳工艺条件为A2B2C2，即硝酸浓度0.6%、反应温度65℃、反应时间24h，在此条件下制备得到的硒化红枣多糖中硒含量可以达到96.98mg/g。

2.5 硒化红枣多糖的紫外光谱分析

图4为红枣多糖、硒化红枣多糖及亚硒酸钠的紫外吸收光谱图。由图4可以看出，原红枣多糖在紫外区域无吸收峰，而硒化红枣多糖却在258nm处有一个强的吸收峰。这说明红枣多糖经硒化后结构上发生了变化，可能生成了新的亚硒酸酯基团。亚硒酸钠在205nm有较强吸收，但与红枣多糖发生硒化反应后仅在258nm处存在明显的吸收峰，说明通过硒化反应与红枣多糖产生了稳定的亚硒酸酯基团，而非简单的物理吸附[25]。

图4 硒化红枣多糖的紫外光谱图Fig.4 UV spectrum of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

2.6 硒化红枣多糖的红外光谱分析

红枣多糖硒化前后的红外吸收光谱如图5所示。由图5可以看出，红枣多糖在3400cm-1位置有吸收峰，是氢键缔合的羟基O-H键的伸缩振动产生的；而硒化红枣多糖的羟基峰向高波数方向移动且吸收减弱，这是由于亚硒酸基的取代改变了局部的空间位置情况，使得羟基参与分子氢键的状态发生了变化，峰高度的减弱表明亚硒酸基发生了取代，使羟基的数目减少。有李柱来报道[26]，硒酸酯（Se=O）在896cm-1附近有伸缩振动峰，对照本图谱，红枣多糖在800~ 900cm-1之间没有吸收峰，而硒化红枣多糖在893cm-1处有一弱吸收峰，此可能归属为亚硒酸酯的特征吸收峰。

图5 硒化红枣多糖的红外光谱Fig.5 FT-IR spectrum of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

3 结论

采用亚硒酸钠为硒化剂，在硝酸催化下可成功合成硒化红枣多糖，而且可保持原红枣多糖的基本结构，试剂简单易得，反应条件相对简单，是一种较好的硒化红枣多糖制备方法。硝酸浓度对红枣多糖硒化修饰的影响最大，其次是反应温度，反应时间的影响最小，硒化红枣多糖制备的最佳工艺条件为：硝酸浓度0.6%、反应温度65℃、反应时间24h，在此条件下制备得到的硒化红枣多糖中硒含量可以达到96.98mg/g。紫外光谱和红外光谱分析表明，红枣多糖与亚硒酸基形成了稳定的亚硒酸酯化合物。

[1] 张俊杰. 硒的生理功能及富硒强化食品的研究进展[J]. 微量元素与健康研究，2000，17（2）：70-72.

[2]Foster LH， Sumar S.Selenium in health and disease：A review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1997，37（3）：211-218.

[3]Yu J，Cui PJ，Zeng WL，et al.Protective effect of seleniumpolysaccharides from the mycelia of Coprinus comatus on alloxan-induced oxidative stress in mice[J].Food Chemistry，2009，117（1）：42-47.

[4]Zhao L，Zhao G，Du M，et al.Effect of selenium on increasing free radical scavenging activities of polysaccharide extracts from a Se-enriched mushroom species of the genus Ganoderma[J]. European Food Research and Technology，2008，226：499-505.

[5]梁英，杨宏志，夏远亮，等.黑木耳硒多糖对小鼠血脂、血硒及过氧化物酶的影响[J]. 营养学报，2000，22（3）：250-252.

[6]宋逍，赵鹏，申婉容，等.款冬花硒多糖的制备及抗氧化性研究[J]. 食品工业科技，2013，34（13）：227-231.

[7]颜炳祥，潘道东，曾小群.乳酸菌胞外多糖硒化修饰及其抗氧化活性研究[J]. 中国食品学报，2012，12（2）：15-23.

[8]沈伟哉，温晓晓，郑颖，等.大蒜多糖及其硒化产物抗氧化活性的比较研究[J]. 营养学报，2011，33（4）：380-384.

[9]白雪，林晨，江振友，等.硒化麒麟菜多糖抑制人喉癌细胞株Hep-2增殖的作用肿瘤防治研究[J].2007，34（4）：249-252.

[10]沈伟哉，王辉，郭国庆，等.总状蕨藻盾叶变种多糖及其硒化产物对小鼠T细胞和NK细胞的调节[J].中国科学C辑：生命科学，2008，38（8）：722-728.

[11]张继，刘忠旺，王风霞，等.兰州百合多糖硒酸酯的合成及表征[J].高分子通报，2009，10：48-52.

[12]梁淑轩，马二红，许成燕，等.枸杞多糖的硒化及其对人宫颈癌细胞的抑制作用[J]. 食品科学，2010，31（9）：243-246.

[13]龚晓钟，欧阳政.硒化黄芪多糖制备条件及其结构的研究[J]. 天然产物研究与开发，1998，10（2）：26-32.

[14]王红连，张东升，张凌裳，等.硒化灵芝多糖制备及免疫学相关研究[J]. 食品科学，2009，30（17）：316-318.

[15]刘捷，张体祥，于立芹，等.硒化红薯叶多糖的制备及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发，2009，30（8）：8-11.

[16]杨晶晶，黄家锟，蒋开年，等.正交设计法优化红景天多糖硒制备工艺及其性质研究[J].中成药，2010，32（6）：1065-1067.

[17]高义霞，周向军，王风霞，等.刺槐豆多糖硒酸酯的制备及表征[J].食品工业科技，2012，（14）：288-290，298.

[18] 高义霞，周向军，李娥 春，等. 刺梧 桐多 糖的硒酸化[J]. 食品与发酵工业，2010，36（12）：134-136.

[19]Li J， Liu Y ， Fan L ， et al.Antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies of Zizyphus jujuba cv. jinsixiaozao[J].Carbohydrate Polymers，2011，84：390-394.

[20]Wang B.Chemical characterization and ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，48（3）：386-391.

[21]徐瑜玲，苗明三，孙艳红，等.大枣多糖对气血双虚模型小鼠造血功 能 的影响[J]. 中 国 临床康 复，2004，24（8）：5050-5051.

[22]Zhao ZH，Li J，Wu XM，et al.Structures and immunological activities of two pectic polysaccharides from the fruits of Ziziphus jujuba Mill.cv.jinsixiaozao Hort[J].Food Research International，2006，39（8）：917-923.

[23] 曹 犇. 木枣多糖抗小鼠运动疲劳的实验研究[J]. 食品科学，2008，29（9）：571-574.

[24] 王艳预，吴海歌，高大 彬，等. 硒多 糖的 研究进展[J]. 化 学与生物工程，2008，25（2）：7-9.

[25]孙兰萍，张胜义，许晖，等.壳聚糖吸附亚硒酸的动力学研究[J]. 食品科学，2006，27（4）：92-95.

[26] 李柱来，林媚，王津，等. 硒化壳聚糖的制备及其表征[J].海峡药学，2005，17（3）：10-13.

Optimization of preparation of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit

ZHANG Chun-ling1，WU Xiao-wei1，2，CHEN Da-lei1，LIU Jie-chao1，JIAO Zhong-gao1，*
（1.Zhengzhou Fruit Research Institute，The Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，China；2.Sanmenxia Secondary School，Sanmenxia 472000，China）

Seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit was synthesized by using sodium selenite as modification agent under the catalysis of nitric acid ，and the synthesis technologies were optimized by orthogonal experiment with the contents of selenium as indicators.Results showed that concentration of nitric acid was the most important factor among the three factors which influenced the synthesis of selenopolysaccharide from Ziziphus jujuba fruit，while the reaction temperature was minor，reaction time was the least. The optimum conditions for synthesis of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit were at 65℃ for 24h by using 0.6%of nitric acid as catalyst.Under these conditions，the selenium content of seleno-polysaccharide from Ziziphus jujuba fruit was up to 96.98mg/g.Analysis with the UV and FT-IR spectrum indicated that stable selenious acid esters were formed between the polysaccharide and selenious acid groups.

Ziziphus jujuba；seleno-polysaccharide；preparation

TS255.3

B

1002-0306（2014）22-0241-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.044

2014－02－27

张春岭（1983-），男，硕士研究生，助研，主要从事果品营养与保鲜加工方面的研究。

* 通讯作者：焦中高（1972-），男，博士，副研究员，主要从事果品营养与保鲜加工方面的研究。

河南省科技攻关计划重点项目（82102140026）；中国农业科学院科研基金和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目（0032007013）