张 宸，严 勃，孟永宏，郭玉蓉，邓 红，魏丽娜

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

解脂耶氏酵母lip2脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的研究

张 宸，严 勃，孟永宏*，郭玉蓉，邓 红，魏丽娜

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

对解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶水解谷维素产生阿魏酸的酶反应体系进行了研究。实验发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉（105U/mg）在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L黄胆酸钠），100mmol/L pH6.0磷酸钠缓冲液（含1000U脂肪酶）的体系中，水解产生阿魏酸的得率为2.94%。为了进一步提高脂肪酶水解效率，对解脂耶氏酵母脂肪酶中主要组分lip2脂肪酶基因进行了克隆，整合至毕赤酵母GS115基因组后发酵制取lip2脂肪酶粉（70.1U/mg），于上述酶解体系中进行水解谷维素实验。实验结果表明阿魏酸产率为2.87%。获得的lip2脂肪酶催化效率略低于全脂肪酶粉催化效率，但是获得了单一的脂肪酶基因，为进一步采取分子进化技术提高其催化能力奠定了基础。

阿魏酸，脂肪酶，解脂耶氏酵母，酶解工艺

阿 魏 酸（Ferulic acid）是 植 物 界 常 见 的 一 种 酚酸，广泛存在于当归、樟白皮等中药材中[1]。它具有镇静、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特功能，且不会在人体内过多累积[2-3]，因此，在食品、医药工业上得到广泛的应用。现阶段工业化生产阿魏酸的方法主要是利用高浓度碱水解谷维素得到阿魏酸。这种方法生产成本高，易造成环境污染[4]。考虑到酶法水解反应条件温和，对环境污染小，且随着固定化酶等技术的出现，可大大降低反应成本[5]，是未来工业化绿色制备阿魏酸的研究重点。

谷维素是由阿魏酸和环木菠萝醇等植物甾醇构成的结合酯，因此，可利用酯酶或脂肪酶水解酯键酶解谷维素制备阿魏酸[6-7]。国外已有采用酯酶来水解谷维素的先例[8]，也包括一些利用阿魏酸酯酶和多糖降解酶的协同作用[9]。

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种能分泌 多 种 代 谢 产 物 的 非 常 规 酵 母[10]，它 能 利 用 甘 油 酯为诱导物，产生多种脂肪酶，具有很多优良特性，是重要的工业用脂肪酶。解脂耶氏酵母共有8个脂肪酶基因，其中lip2脂肪酶更是一种性能优良的脂肪酶，具备很高的酯化、水解和转酯化活性，目前已被广泛应用到酯水解和合成，生物柴油制备等领域[11-12]。

本文选取解脂耶氏酵母为研究材料，发酵获得全脂肪酶粉，对酶水解谷维素产生阿魏酸的酶解体系进行初步筛选。同时采用毕赤酵母表达系统，获得高效表达lip2脂肪酶的基因工程菌G115/lip2，并对lip2脂肪酶粉水解谷维素的能力进行了研究，为酶法工业化制备阿魏酸的绿色工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毕 赤 酵 母GS115、E.coli DH5α 菌 株 购 于 中 国微 生 物 菌 种 保 藏 中 心 ；Y.lipolytica菌 株 、pPic9K质粒 本实验室保存；谷维素（纯度99.3%） 西安海斯夫生物科技有限公司；阿魏酸标品（纯度99.9%）

Sigma公司；其他所有化学试剂 天津市科密欧化学试剂有限公司和Sigma上海分公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶及相关试剂 购自TaKaRa、Promega、Sigma 公 司 及 国 内 各 生 产 厂 商 ；DNA胶回收试剂盒、DNA Marker 均购自上海生工生物有限公司。

梯度PCR仪 Applied Biosystems公司；AG 22331型电穿孔仪 Eppendorf公司；LC-10AT型高效液相色谱仪 岛津仪器苏州有限公司；Z-16PK型低温离心机 Sigma公司。

1.2 引物

用于扩增解脂耶氏酵母基因组上lip2脂肪酶基因的上下游引物分别为：P1（5’-AAGAATTCATGAA GCTTTCCACCATCCT-3’），P2（5’-TTGCGGCCGCTT ATTAAAGTAGATAGTT-3’），其中划线部分分别为引入的EcoRⅠ与NotⅠ酶切位点；用于鉴定外源基因整合至毕赤酵母GS115基因组his4位点的上下游引物（依据巴斯德毕赤酵母表达手册）为：P3（5’-GACT GGTTCCAATTGACAAGC-3’），P4（5’-GGCAAATGG CATTCTGACATC-3’）。引物合成和DNA序列分析分别在南京金斯瑞生物有限公司和上海生工生物有限公司完成。

1.3 培养基

LB、YPD、BMGY、BMMY、MD、MM等培养基参考Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册。酶活检测平板为含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY培养基平板；液体摇瓶发酵培养基：鱼蛋白胨6%，豆油4%，尿素0.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，其中尿素过滤除菌（0.22μm）。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪酶粉的制备 挑取酵母菌单菌落接种于5mL YPD培养基中，于30℃振荡培养12～14h，然后以1%接种量接种至脂肪酶发酵培养基中，30℃，220r/min发酵72h；将发酵液于3000r/min离心10min，取上清酶液并加入3%的PEG2000，电磁搅拌2h溶解，滤纸过滤后取滤纸上的固体物质，加入3倍体积的冷酒精洗脱3次，冷丙酮洗2次，最后制得的固体自然风干，即得到酶粉[13]。

1.4.2 酶粉酶活测定方法 脂肪酶活性测定采用碱滴定法[14]。操作步骤如下：酶活力测定以橄榄油乳化液（橄榄油∶PVA=1∶3，v/v）为底物。取37℃温浴后的5mL橄榄 油 乳 化 液 和4mL 100mmol/L pH8.0的 PBS，加入适当溶解稀释的1mL脂肪酶粉，于37℃、130r/min反应10min，加入15mL无水乙醇以终止反应。酶催化水解产生的脂肪酸通过50mmol/L的NaOH滴定测定，加两滴0.5%酚酞指示滴定终点。在37℃，pH8.0的条件下，脂肪酶每分钟水解橄榄油产生1μmol/L游离脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单位（U）。

1.4.3 阿魏酸含量的测定 采用高效液相色谱法对阿 魏 酸 含 量 进行 检测[15]，检 测 波 长 为315nm，色 谱 柱为Welch Ultimate XB-C18色谱柱（4.6×250mm，5μm，Welch Materials公司），流动相组份及配比为甲醇∶水∶冰乙酸=35∶65∶0.9，流速为1.0mL/min。

1.4.4 脂肪酶粉水解谷维素酶解体系实验 取20mg的谷维素样品于500μL丙酮溶解后加入25mL具塞三角瓶中，并在不同的水解体系[8，16-17]中（水解体系见结果中表1）加入1000U脂肪酶粉，于37℃，140r/min反应48h。以HPLC法测定阿魏酸含量并计算得率。

1.4.5 载体的构建与转化 以解脂耶氏酵母基因组DNA为模板，利用P1和P2为引物扩增lip2基因，PCR产物胶回收纯化并与pGEM T-easy载体相连，连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α后筛选阳性克隆子，插入的基因通过测序确认。对测序正确的克隆子过夜培养抽提质粒，使用EcoRⅠ和NotⅠ对质粒进行双酶切得到具有粘性末端的目的条带，经T4连接酶16℃过夜连接至用相同内切酶双酶切后的表达载体pPic9K中，构建得到pPic9K/lip2重组质粒，对重组质粒进行测序验证。验证正确的重组质粒pPic9K/lip2按照毕赤酵母表达手册，用his4位点上的SalⅠ内切酶得到10μg线性化质粒DNA与80μL GS115感受态细胞混合，1.5kV电击转化后将细胞涂布到不含组氨酸MD平板上，28℃培养2～3d，成功转化的his+转化子可在无组氨酸的MD平板上生长。

1.4.6 毕赤酵母转化子表型鉴定、筛选及验证 将转化后所得到的阳性转化子于MD和MM平板上进行Mut+/Muts表型鉴定；并采用G418浓度梯度YPD平板筛 选 毕 赤 酵 母 多 拷 贝 转 化 子[19]；以 筛 选 得 到 转 化 子的基因组为模板，P3和P4引物进行PCR扩增验证基因表达盒的正确插入；阳性转化子点接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，观察其脂肪酶表达能力[18]。阳性重组子命名为GS115/lip2。

1.4.7 lip2脂肪酶粉水解谷维素实验 对重组子经发酵制取的lip2脂肪酶粉，测定其脂肪酶活性，并运用全脂肪酶粉最优酶解体系进行谷维素水解实验，HPLC法测定阿魏酸含量，并计算阿魏酸得率。

1.5 数据处理

阿魏酸得率的按照下式进行计算：

表1 解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷维素制取阿魏酸的得率Table 1 The ferulic acid yield of oryzanol hydrolysis by Yarrowia lipolytica lipase powder

2 结果与分析

2.1 脂肪酶水解谷维素酶解体系优化实验

通过1.4.1方法制取解脂耶氏酵母全脂肪酶粉，并经碱滴定法测得解脂耶氏酵母全脂肪酶粉酶活为105U/mg。

由表1可知，未加入解脂耶氏酵母全脂肪酶粉的体系2和体系3中，阿魏酸产量很少或者几乎没有，其中，含牛黄胆酸钠的体系2水解效率略优于不含牛黄胆酸钠的体系3，说明牛黄胆酸钠作为乳化剂，可增大反应液中油水两相的接触面积，使更多的谷维素与水相遇发生水解反应，进而提高了阿魏酸的得率。体系1、4、5、6中均加入了1000U的全脂肪酶粉，阿魏酸得率均有很大的提高。说明解脂耶氏酵母脂肪酶粉对谷维素确实具有水解作用，但其阿魏酸得率不高。对比体系1与体系4可以得出，使用牛黄胆酸钠作为乳化剂其作用效果优于使用PVA-1750作为乳化剂；而使用50mmol/L pH7.0 Tris-HCl作为酶解反应的缓冲液，阿 魏 酸 产 量 要 大 于 使 用100mmol/L pH7.0 PBS的 反应缓冲液，其原因可能是由于Tris-HCl中的离子更能保护及稳定脂肪酶的构象及活力，使其在反应体系中保持稳定的底物转化能力。由阿魏酸得率可知，谷维素在50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（含7.5mmol/L牛黄胆酸钠），100mmol/L pH6.0磷酸钠缓冲液（含1000U脂肪酶）的酶解体系中得率最高，产率可达到2.94%。

图1 lip2 PCR扩增产物（A）及pPic9K-lip2双酶切验证（B）Fig.1 PCR amplification of Y.lipolytica lip2 gene（A） and double digestion of the plasmid by EcoRⅠ and NotⅠ（B）

2.2 lip2脂 肪 酶 基 因 的 克 隆 与pPic9K-lip2表达载体的构建

以解脂耶氏酵母DNA为模板，P1和P2作为引物扩增得到的lip2脂肪酶基因，大小约为1005bp，见图1（A）。测序结果与NCBI上lip2脂肪酶基因序列比对结果序列一致。生物信息学分析结果显示，lip2脂肪酶蛋白含334个氨基酸，其蛋白分子式为C1659H2549N437O488S13，相对分子质量为36840.9，等电点为5.57，总原子数为5146；脂溶指数为93.38，疏水性平均值为-0.005，说明lip2脂肪酶是一个脂溶性、疏水性蛋白。

PCR产物回收后进行TA克隆，对测序正确的阳性克隆子抽提质粒，与载体pPic9K分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切处理后T4过夜连接，构建分泌型表达载体pPic9K-lip2（图2）。pPic9K-lip2双酶切电泳见图1（B），测序分析结果验证载体构建正确。

图2 毕赤酵母分泌表达载体pPic9K-lip2框架图Fig.2 Schematic diagram of the Pichia recombinant expression plasmids pPic9K-lip2

2.3 毕赤酵母重组子的转化和鉴定

经内切酶SalⅠ线性化后的表达载体pPic9K-lip2电转化至P.pastoris GS115中，得到的转化子经MD和MM平 板 鉴 定 为His+/Mut+ 型 。 于 高G418 浓 度（＞1.5mg/mL）的抗性平板上筛选得到毕赤酵母多拷贝转化子，共计16株。异硫氢酸胍法快速提取毕赤酵母转化子的基因组DNA为模板，P3和P4为引物，PCR验证基因表达盒是否成功插入毕赤酵母基因组his4位点，结果如图3所示。从PCR结果来看，筛选到的毕赤酵母GS115/lip2重组子都能扩增出两条片段，分别是AOXI基因片段（2.2kb）和约1.5kb片段（片段大小=目的基因长度+492bp），表明所挑选的转化子都是阳性克隆，且属于Mut+型。

图3 毕赤酵母GS115/lip2阳性重组子的PCR验证Fig.3 PCR of positive recombinant

将阳性转化子点接在含有0.2%三丁酸甘油酯的BMMY平板上，培养24~48h后，发现这些阳性重组子均能产生水解透明圈（图4）说明毕赤酵母GS115/lip2重组子可以有效表达脂肪酶。

图4 毕赤酵母GS115/lip2重组子分解三丁酸甘油脂产生透明圈Fig.4 Transparent circle formation of recombinant on tributyrin agar plate

2.4 lip2脂肪酶粉水解谷维素制取阿魏酸实验

对16株毕赤酵母GS115/lip2重组子进行摇瓶发酵，分别对发酵液测定其脂肪酶活力。选取催化活力最高的一株重组子重新进行发酵，通过1.4.1方法制取lip2脂肪酶粉，经碱滴定法测得lip2脂肪酶粉酶活达到了70.1U/mg。

以2.1中的最优水解体系（体系1和体系5）按1.4.4方法进行lip2脂肪酶酶粉水解谷维素制备阿魏酸实验，HPLC法测定阿魏酸产量，体系1和体系5阿魏酸得率分别为2.07%和2.87%。由结果可知，毕赤酵母GS115/lip2重组子lip2脂肪酶粉对谷维素具有一定水解作用，且阿魏酸得率略低于解脂耶氏酵母全脂肪酶粉水解谷维素的阿魏酸得率（约2.94%）。其原因可能在于：一是全脂肪酶粉中可能含有对谷维素水解效率较高的其他同工脂肪酶；二是各个脂肪酶作用于谷维素时可能会产生协同作用，提高了脂肪酶的单一作用效果。

本研究虽然发现了解脂耶氏酵母脂肪酶对谷维素有一定的水解作用，但是阿魏酸得率较低。可能的原因有：解脂耶氏酵母脂肪酶谷维素水解特异性较差，水解效率不高；酶水解反应体系还需要继续优化和筛选；所制得的脂肪酶粉酶活相对较低，酶粉质量不高，其在酶水解谷维素体系中的扩散性不好，可能也会影响到对谷维素的水解效率。

另外，在解脂耶氏酵母基因组中有lip1~lip8脂肪酶同工酶基因。本文只研究了lip2脂肪酶水解谷维素制备阿魏酸的能力，其他的同工酶基因可以参照本文中的方法继续研究，有一定的借鉴意义。

3 结论

对解脂耶氏酵母发酵所制得的全脂肪酶粉，进行了谷维素酶水解制备阿魏酸实验，结果发现解脂耶氏酵母全脂肪酶粉对谷维素有一定的水解效率，水解反应条件为：50mmol/L pH7.0 Tris-HCL（包含7.5mmol/L牛 黄 胆 酸 钠），100mmol/L pH6.0 磷 酸 钠 缓冲液（包含1000U脂肪酶粉），阿魏酸得率为2.94%。同时运用分子生物学手段，成功获得了高效表达lip2脂肪酶基因的GS115/lip2基因工程菌，研究发现其制得的lip2脂肪酶对谷维素也具有水解作用，阿魏酸得率为2.87%。通过本研究，证明了解脂耶氏酵母lip2脂肪酶对谷维素有一定的水解效率。因此，可在本研究的基础上，可利用分子进化技术，对lip2脂肪酶基因进行分子改造，继续进行高效能脂肪酶的筛选研究，以期获得高谷维素特异性的酵母菌脂肪酶，为酶法工业化水解谷维素制备阿魏酸的绿色工艺奠定基础。

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Production of ferulic acid from oryzanol by Y.lipolytica lip2 enzyme-catalyzed

ZHANG Chen，YAN Bo，MENG Yong-hong*，GUO Yu-rong，DENG Hong，WEI Li-na
（Shaanxi Normal University，College of Food Engineering and Nutritional Science，Xi’an 710062，China）

An appropriate enzymatic system was preliminary explored for the Yarrowia lipolytica lipase.The study found that the optimal enzyme reaction system for the whole lipase powder was 50mmol/L pH7.0 Tris-HCl（containing 7.5mmol/L ammonium taurocholate），100mmol/L pH6.0 PBS（containing 1000U lipase powder），and the ferulic acid yield was 2.94%.To further improve the efficiency of hydrolysis of lipase，lip2 lipase gene was cloned and integrated in Pichia pastoris GS115 genome，and the lip2 lipase powder was obtained by fermentation.Using the optimal enzyme reaction system to hydrolysis oryzanol，the results showed that the ferulic acid yield by lip2 lipase powder was 2.87%.This efficiency was slightly lower than the whole lipase powder hydrolysis efficiency.However，a single lipase gene was obtained，which would lay the foundation of improving the catalyze ability to hydrolysis oryzanol by molecular evolution technology.

ferulic acid；lipase；Yarrowia lipolytica；hydrolysis process

TS222.1

A

1002-0306（2014）22-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.033

2014－02－24

张宸（1988-），女，硕士研究生，主要从事食品生物工程方面的研究。

* 通讯作者：孟永宏（1975-），男，博士，副教授，主要从事食品生物工程方面的研究。

陕西省科技统筹（2011KTCQ02-04）；教育部博士点专项科研基金（20130202120007）；2012年度中央高校科研基本业务费重点项目。