颜成英，汤晓艳，王 敏，康大成，李朋颖，龚 艳

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2.南京农业大学，教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京 210095）

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白提取及多抗制备

颜成英1，2，汤晓艳1，*，王 敏1，康大成1，李朋颖1，龚 艳1

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2.南京农业大学，教育部肉品加工与质量控制重点实验室，江苏南京 210095）

鼠伤寒沙门氏菌是沙门氏菌属常见致病菌，其鞭毛蛋白具有抗原性，可诱导免疫系统产生针对该蛋白的抗体。实验采用直接提取法获得鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，并以该蛋白为抗原免疫小鼠，制备鞭毛蛋白多抗，使用间接ELISA方法测定多抗的效价和特异性。SDS-PAGE实验结果表明，蛋白条带单一，分子量大小为57ku，说明提取的鞭毛蛋白是目标蛋白且纯度较高；间接ELISA检测结果表明，制备多抗的效价为1∶102400，除与猪霍乱沙门氏菌发生交叉反应外，与其他6种沙门氏菌和6种常见非沙门氏菌属的致病菌均不发生反应，说明该抗体的效价较高，特异性较好，可以用于与磁珠的偶联，为免疫磁珠的制备打下基础。

鼠伤寒沙门氏菌，鞭毛蛋白，多抗

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是沙门氏菌属最常见的血清型，是造成食物中毒和人类肠胃炎的重要致病菌，也是导致鸡肉及相关产品污染的主要原因[1]。据统计2010年由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒事件占沙门氏菌食物中毒事件总数的22.8%[2]。对于沙门氏菌的检测，虽然传统检测方法准确度较高，但是耗时、耗力[3]，为了满足快速检测的要求，国内外学者发明并发展了以免疫学为基础的[4]或以分子生物学为基础的[5]快速检测方法。因免疫学检测方法无需特殊仪器，且具有反应成本较低、易于操作、易于基层推广等特点，在沙门氏菌的检测中占有重要地位[6]。免疫磁性分离法（IMS）是免疫学方法之一，该方法是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面制成免疫磁珠，免疫磁珠与样品中的目标细菌特异性结合，在外加磁场的作用下，达到将目标细菌分离、浓缩的目的。近年来IMS技术已广泛用于各种致病菌[7-8]、生物大分子的检测[9]。IMS技术的核心材料是可与磁珠偶联的抗体和可偶联抗体的磁珠，本实验的目的在于首先获得鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，然后免疫BALB/c小鼠，最终获得鞭毛蛋白多抗，同时检验多抗的特异性和效价，为鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠的制备和将该免疫磁珠应用于鼠伤寒沙门氏菌的检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鼠伤寒沙门氏菌等共14种菌株 中国微生物菌种保藏中心；BALB/c小鼠（6～8周） 北京实验动物研究中心维通利华公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂 美国GIBCO BRL公司；牛血清蛋白（BSA） 北京鼎国生物技术有限公司；HRP标记羊抗鼠抗体 上海楷洋生物技术有限公司；BCA试剂盒 美国Thermo Scientific公司；其他普通化学试剂 均为国产分析纯。

D-1型自动蒸汽灭菌锅 北京恩发科技有限公司；SKY-1102c型恒温摇床 上海苏坤仪器设备公司；全能台式高速冷冻离心机 德国Thermo公司；NanoDrop 2000C 型 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 美 国Thermo Fisher公司；垂直电泳仪 美国BIO-RAD公司；CP80WX型冷冻超速离心机 日本Hitachi Koki公司。

1.2 实验方法

1.2.1 配制液体培养基 根据文献[10]配制改进液体培养基，该培养基可促进菌种的复苏，也可诱导鞭毛的生长。培养基具体配制方法如下，A溶液的配制：（NH4）2SO410.0g，Na2HPO430.0g，KH2PO415.0g，NaCl l5.0g，Na2SO40.055g溶 解 于1L双 蒸 水 中 ，用 1mol/L NaOH调节pH到7.2。B溶液的配制：MgCl20.25g，CaCl20.013g，FeCl3·7H2O 0.0006g，酵 母 浸 膏 0.125g，DL- 色氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、DL-α-丙氨酸、L-蛋氨酸、甘氨酸各0.31g溶解于1L双蒸水中，用1mol/L HCl调节pH到7.2。A、B液分别高压蒸气灭菌，100mL溶液A与400mL溶液B混合，再加入10mL 25%（w/v）无菌葡萄糖溶液。

1.2.2 鞭 毛 蛋 白 的 提 取 鞭 毛 蛋 白 的 提 取 参 考Ibrahim[11]介绍的方法，具体步骤是：将鼠伤寒沙门氏菌接种于含有500mL培养液的1000mL锥形瓶中，37℃，80r/min振荡培养18h然后5000×g离心30min收集细菌，加入35mL灭菌生理盐水溶解细菌沉淀，加入1mol/L的HCl调pH至2.0，室温磁力搅拌30min，5000×g离心30min后弃沉淀，将上清进一步100，000×g离 心 lh后 弃 沉 淀 ，收 集 上 清 液 ，缓 慢 加 入 1mol/L NaOH调pH至7.2，量取上清液的体积，缓慢加入（NH4）2SO4至 终 浓 度 为2.67mol/L，边 加 边 磁 力 搅 拌 ，使（NH4）2SO4完全溶解，混悬液4℃放置过夜，15，000×g 4℃离心15min，弃上清液，用约5mL灭菌蒸馏水使沉淀溶解完全。将溶解物转移至预先处理过的透析袋，流水透析2h，之后将透析袋放入4L含20g活性炭的灭菌蒸馏水中，4℃条件下磁力搅拌18h，透析过的鞭毛蛋白小量分装，20℃冻存。

1.2.3 鞭毛蛋白SDS-PAGE 用4%的浓缩胶（上层胶），10%的分离胶（下层胶）作为分离载体进行电泳，考马斯亮蓝染色，具体操作按照文献[12]中的方法进行。

1.2.4 鞭毛蛋白浓度的测定 使用BCA法检测鞭毛蛋白浓度，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 小鼠鞭毛蛋白抗血清的制备 参照文献[13]免疫小鼠，多点皮下注射BALB/c小鼠，50μg/只。每隔2周加强免疫一次，从第三次免疫后开始监测血清，于加强免疫后7d眼眶采血，检测抗血清效价。待效价稳定后，断头采血，4℃静止12h，离心后取上清液，加等量甘油，-20℃冻存。

1.2.6 抗体效价及特异性检测 抗血清效价的检测使用间接ELISA法[14]，鞭毛蛋白抗原稀释104倍包被酶标板，抗血清以1∶100为起始浓度做2倍比稀释，未免疫小鼠血清为阴性对照，二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG稀释4000倍，用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD450值，检测孔/阴性对照孔的P/N值＞2．1判为阳性。特异性检测使用8种沙门氏菌和6种常见非沙门氏菌属致病菌包被酶标板，利用间接ELISA方法检测抗体的特异性，未免血清（80000×稀释）做阴性对照。

2 结果与分析

2.1 鞭毛蛋白的提取和检测

鞭毛是致病菌发挥致病作用必需的毒力决定成分[15]，鞭 毛 蛋 白 可 以 通 过 直 接 提 取[16-17]和 原 核 表达[18-19]两种方法获得，本研究采用酸解法直接提取鞭毛蛋白。先将重悬后的菌体细胞调pH至2.0并在4℃条件下磁力搅拌30min使菌体与鞭毛充分分离，消除RNA等污染物对鞭毛提取的影响，然后再经不同pH环境和不同离心速度处理后，得到富含鞭毛蛋白的溶 液 ，最 后 使 用（NH4）2SO4盐 析 获 得 目 标 鞭 毛 蛋 白 。Ibrahim[11]和Strindelius等[20]均用此方法获得了纯度较高的目标鞭毛蛋白。本实验SDS-PAGE检测结果显示，凝胶成像系统分析蛋白条带主要在57.0ku处（见图1），实验结果与Ibrahim[11]一致。而王鹤等通过FliC基因原核表达方法获得的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的 分 子 量 为56ku[19]，两 种 方 法 获 得 鞭 毛 蛋 白 的 分 子量不相同，可能是由于菌株一级结构不同造成的[21]。

图1 鞭毛蛋白SDS-PAGE结果Fig.1 The SDS-PAGE result of flagellin

BCA法测得鞭毛提取物的蛋白浓度为3.51mg/mL，共5mL，故每500mL肉汤培养液提取鞭毛蛋白约17mg。

2.2 小鼠鞭毛蛋白抗血清效价测定

抗血清效价测定实验结果如表1所示，实验发现当抗原浓度一定时，随着抗体稀释度的增加，P/N值呈现先保持不变到逐渐降低的趋势，以样本孔OD450值与阴性对照孔OD450的比值大于2.1为阳性，以阳性孔的最大稀倍数为效价可知，制备的鞭毛蛋白多抗的效价是1∶102400。

表1 鞭毛蛋白多抗效价的测定Table 1 The valence detection of the antibody

2.3 抗血清特异性测定

间接ELISA法测定抗血清特异性结果见表2。从表中数据可知，制备的鞭毛蛋白多抗仅与鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌反应，与其他6株沙门氏菌、6株常见非沙门氏菌属致病菌均不反应，说明多抗的特异性较好。

表2 鞭毛蛋白多抗特异性检测Table 2 The specificity detection of the antibody

综合抗血清的效价和特异性实验结果可知，制备的抗血清效价高、特异性强，可用于免疫磁珠的制备。虽然抗血清与猪霍乱沙门氏菌存在交叉反应，制备的免疫磁珠也可能富集猪霍乱沙门氏菌，但是该缺点可通过将免疫磁珠与ELISA、PCR等其他检验技术联用的方法进行克服，使该方法具有更高的特异性、灵敏度和分离效率。

3 结论

采用直接提取方法获得了鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白，蛋白SDS-PAGE实验结果显示，蛋白条带单一且分子量大小为57ku，说明提取的鞭毛蛋白是目标蛋白且纯度较高；以该蛋白为抗原免疫小鼠制备得到鞭毛蛋白多抗，间接ELISA方法测定多抗的效价为1∶102400，且除与猪霍乱沙门氏菌发生交叉反应外，与其他6种沙门氏菌和6种常见非沙门氏菌属的致病菌均不发生反应，说明该抗体的效价较高，特异性较好，可以用于与磁珠的偶联，为免疫磁珠的制备打下基础。

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Extraction of flagellin from Salmonella typhimurium and preparation of its polyclonal antibody

YAN Cheng-ying1，2，TANG Xiao-yan1，*，WANG Min1，KANG Da-cheng1，LI Peng-ying1，GONG Yan1
（1.Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Salmonella typhimurium is the most common pathogenic bacterium in salmonella and had flagellin of antigenicity which could induce immune system to produce antibody.Our research adopted direct extract method to get flagellin of salmonella，and used this protein as antigen to immune mice for flagellin polyclonal antibody.In this research，valence and specificity of antibody were tested through indirect ELISA testing.SDSPAGE experiment showed protein stripe was single and molecular weight was 57ku，which means extracted flagellin was the target protein and it’s of high purity.ELISA testing indicated that the valence of antibody was 1 ∶102400 and it had cross reaction with Salmonella choleraesuis only while it didn ’ t react with other 6 salmonella and 6 common pathogenic bacteria of non-salmonella.It stated this antibody had high valence and good specificity and could be used to couple with magnetic bead.

Salmonella typhimurium；flagellin；polyclonal antibody

TS251.7

A

1002-0306（2014）22-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.030

2014－02－24

颜成英（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：畜产品质量与安全。

* 通讯作者：汤晓艳（1976-），女，博士，研究员，研究方向：畜产品质量与安全标准与检测。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B03）；国家自然青年科学基金项目（31000799）；国家现代农业产业技术体系专项（CARS-42）。