郭金玲，罗发燕，黄 瑞，，龚大春

（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443002；2.三峡大学新能源研究院，湖北宜昌 443002）

双水相萃取分离重组毕赤酵母碱性木聚糖酶

郭金玲1，罗发燕1，黄 瑞1，2，龚大春2

（1.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌 443002；2.三峡大学新能源研究院，湖北宜昌 443002）

利用双水相萃取技术对来源于重组毕赤酵母的碱性木聚糖酶进行了初步分离。研究了聚乙二醇（PEG）分子量、PEG浓度、盐种类及浓度、NaCl加入量和pH等因素对萃取效果的影响。结果表明，在PEG 4000浓度为20%，Na2HPO4浓度为18%，NaCl浓度为0，pH6.0的条件下，获得最佳萃取效果，其结果为：分配系数（K）8.51，酶的活力回收率（Y）87.2%，纯化倍数（PF）2.54。

双水相萃取，碱性木聚糖酶，分离

木聚糖酶是指能专一降解木聚糖生成低聚木糖和木糖的一组酶的总称，具有重要的应用价值，自上世纪80年代以来，其应用领域不断扩大[1]。碱性木聚糖酶是在碱性条件下具有较高酶活的木聚糖酶，可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，减少传统漂白工艺中氯的用量，降低排污负荷，有利于环境保护，同时还可以改善纸张品质[2]。因此，碱性木聚糖酶及其潜在的工业应用前景引起了人们的广泛关注。

酶制剂的分离纯化是其应用的前提，目前，木聚糖酶的纯化多采用盐析和柱层析方法，但是纯化成本偏高，因此，开发出一套低成本且适合工业化的纯化方法将具有重要的应用价值。双水相萃取技术始于20世纪60年代，它不仅设备简单，可连续操作，易于放大，且操作条件温和，克服了常规萃取中有机溶剂对生物物质的变性作用，在萃取过程中保持生物物质的活性及构型，已成功用于蛋白质、核酸和抗体等高附加值生物产品的分离纯化[3-4]。国内外研究者已经尝试利用双水相萃取技术分离木聚糖酶[5-7]，而对碱性木聚糖酶的双水相分离策略还很少有报道。

本研究利用双水相萃取技术对重组毕赤酵母碱性木聚糖酶进行分离，并对萃取条件进行了摸索，以期为碱性木聚糖酶的工业化生产和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毕赤酵母 Pichia pastoris，三峡大学新能源研究院生物质能研究所提供；木聚糖 北京拜尔迪生物技术有限公司；牛血清白蛋白 上海川翔生物科技有限公司，纯度≥95%；考马斯亮蓝G-250 广州翔博生物科技有限公司，纯度≥75%；PEG（聚乙二醇，分 子 量 1000 、2000 、4000 、6000）、（NH4）2SO4、MgSO4，K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、HCl、无 水甲醇等 均为市售分析纯。

AR2140型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；SW-CT-1D型净化工作台 苏州净化设备有限公司；ZHWY-1102型恒温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；电热恒温振荡水槽上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制

1.2.1.1 YPD固体培养基（g/L） 酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，琼脂粉20.0。

1.2.1.2 YPD液体培养基（g/L） 酵母提取物10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。

1.2.1.3 发酵基础培养基（g/L） 葡萄糖10.0，酵母提取物10.0，MgSO40.03，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.5，pH6.0。

1.2.2 粗酶液的制备 菌种活化：按比例配制一定量YPD固体培养基，于121℃下高压灭菌20min，倒平板，待培养基冷却，在无菌条件下将保藏于甘油管中重组毕赤酵母接种至平板上，放置28℃恒温培养箱中培养至长出明显菌落。

二次活化：按比例配制一定量YPD液体培养基，灭菌后按装液量25mL/250mL分装到锥形瓶，无菌条件下，用接种环从已长出明显菌落的平板上挑取菌种接种到锥形瓶中，置于28℃恒温摇床振荡培养24h。

甲醇流加发酵培养：按比例配制发酵基础培养基，灭菌后按装液量25mL/250mL分装到锥形瓶中，以10%（v/v）接种量将二次活化菌液接种至发酵基础培养基中，再用移液枪按装液量1.5%（v/v）流加无水甲醇，置于28℃，150r/min的恒温摇床振荡培养，每隔24h流加一次甲醇。

粗酶液制备：培养96h后结束发酵，将发酵液放置4℃冰箱静置沉淀，用之前离心除去酵母细胞和杂质。

1.2.3 双水相体系制备 取一支20mL离心管，洗净烘干，按所需比例称入PEG、无机盐、NaCl等试剂后，加入一定量蒸馏水并加热使其溶解，用NaOH或HCl调节系统的pH至所需值后加入1mL粗酶液，用蒸馏水补充至体系总质量为10.0g，振荡摇匀，3000r/min离心3min使其分层。记录上下相体积，分别测定上下相蛋白质浓度和碱性木聚糖酶活性。

1.2.4 酶活力的测定 取0.9mL用pH8.0 Tris-HCl配制的1.0%木聚糖溶液于10mL加塞玻璃管中，加入稀释酶液0.1mL，混匀，50℃水浴10min，取出后立即加入DNS试剂2mL，沸水浴5min，流水冷却后，用蒸馏水定容至10mL，混匀后于波长540nm比色，以灭活的稀释酶液为对照，每组做3个平行实验，结果取平均值，根据光密度值从标准曲线上得出还原糖浓度。在上述条件下，每分钟释放1μmol还原糖（以木糖计）所需要的酶量为一个酶活力单位IU。

1.2.5 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G-250法，以牛血清蛋白作为标准蛋白，通过测定595nm下的吸光度值制作标准曲线并根据样品吸光度值计算其中的蛋白质含量。

1.2.6 指标的计算

1.2.6.1 相比（R） 为上相和下相的体积比，公式如下：

R=Vt/Vb，其中Vt和Vb分别指的是上下两相的体积；

1.2.6.2 分配系数（K） 指上相酶活力Xt与下相酶活力Xb之比，公式如下：

1.2.6.3 酶活回收率（Y） 上相萃取总酶活与加入粗酶液酶活之比。

1.2.6.4 纯化倍数（PF） 指上相比酶活与粗酶液的比酶活之比。

采用Origin 7.5软件分析实验数据，所有实验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 PEG分子量的确定

成相聚合物的相对分子质量是影响蛋白质分配平衡的重要因素，它通过改变聚合物与蛋白质疏水区域之间的疏水相互作用影响蛋白质在双水相系统中的分配行为[9-10]。因此，最佳聚合物分子量的选择在双水相萃取实验中至关重要。为了确定萃取碱性木聚糖酶的最适PEG分子量，分别以不同分子量PEG和（NH4）2SO4构 成 的 双 水 相 体 系 进 行 实 验 ，萃 取 条件为：PEG分子量范围1000~6000，PEG浓度18%，（NH4）2SO4浓 度 12% ，pH5.0，不 加 入 NaCl，结 果 列 于表1。

由表1可知，当PEG分子量为1000时，体系不分层，无法对粗酶液进行萃取分离。当PEG分子量由2000~6000时，酶的分配系数K、酶活回收率Y、蛋白纯化倍数PF都呈现先增大后减小的趋势。这是由于随着高聚物分子量的增加，高聚物分子与酶分子之间的疏水相互作用增大，因此，分配系数和回收率呈上升趋势；然而，随着分子量的继续增加，分配系数和回收率呈迅速下降趋势，这可能是由于聚合物空间位阻增大的结果[11]。当PEG分子量为4000时，碱性木聚糖酶在此双水相体系中的K、Y和PF值均为最大，分别为5.39、84.1%和1.39。因此，在后续的研究中选择分子量为4000的PEG分离毕赤酵母碱性木聚糖酶。

表1 PEG分子量对碱性木聚糖酶萃取效果的影响Table 1 Effect of PEG molecular weight on the extraction of alkaline xylanase

2.2 PEG浓度的影响

高聚物的浓度同样是影响双水相系统萃取效果的关键因素。由2.1确定了最佳高聚物为PEG 4000，固 定 其 他 萃 取 条 件 ：即（NH4）2SO4浓 度 12% ，萃 取pH5.0，不 加 入 NaCl，研 究 了 PEG 4000 浓 度（16%~ 24%）对碱性木聚糖酶萃取效果的影响。

由表2可以看出，随PEG浓度的增大，相比R呈不断上升的趋势；当PEG 4000浓度由16%增加至20%时，酶的分配系数K、酶活回收率Y、纯化倍数PF都逐渐增加，这是由于随着高聚物浓度的增大，其与蛋白质分子之间的疏水作用力增加，使得目标酶更容易分配在高聚物相；但是随着浓度的继续增大，酶的分配系数K和蛋白纯化倍数PF反而逐渐下降，这是由于随着聚合物浓度的增加，上相自由体积减小，导致分配于上相中的蛋白质减少[12]；然而，由于相比的增大，使得酶的总回收率变化不大。综合考虑各考察指标，确定PEG 4000浓度为20%，此时分配系数、回收率和蛋白纯化倍数分别为6.07、85.2%和1.64。

表2 PEG 4000浓度对碱性木聚糖酶萃取效果的影响Table 2 Effect of PEG 4000 concentration on the extraction of alkaline xylanase

2.3 最佳无机盐种类的确定

不同种类盐的正负离子在双水相体系中的分配系数不同，从而改变双水相系统的相间电位，同时，盐的种类和浓度还会改变蛋白质的表面疏水性，最终影响蛋白质在两相间的分配平衡[9]。因此，成相盐的选择也是双水相萃取操作中的重要环节。根据2.1和2.2的研究结果，固定PEG 4000浓度20%，萃取pH 5.0，不加入NaCl，研究（NH4）2SO4、K2HPO4、Na2HPO4和KH2PO4等成相无机盐对碱性木聚糖酶萃取效果的影响，结果如表3所示。

在实验的三个浓度下，KH2PO4与PEG 4000均无法形成两相体系。由表3数据可知，在由（NH4）2SO4、Na2HPO4、KH2PO4与PEG 4000构成的双水相体系中，Na2HPO4/PEG 4000体系萃取效果最好，分配系数K、酶活回收率Y和纯化倍数PF都明显高于其他两种盐，因此，选择Na2HPO4作为成相盐进行下一步研究。

2.4 Na2HPO4浓度的影响

为了研究成相盐浓度对碱性木聚糖酶在双水相体系中分配特性的影响，在上述研究的基础上，固定其他萃取条件为：PEG 4000浓度20%，pH5.0，不加入NaCl，考察了成相盐Na2HPO4浓度在16%~24%变化时，双水相体系对碱性木聚糖酶的萃取效果（表4）。

如表4所示，相比R随Na2HPO4浓度的增大逐渐降低；当盐浓度低于18%时，随着其浓度的增大，分配系数K和回收率Y都成上升趋势，这是由于成相盐的盐析作用，使得更多的碱性木聚糖酶分配在双水相体系的上相；然而，当Na2HPO4浓度大于20%时，酶的分配系数和回收率迅速降低，这主要归于过高浓度盐导致的蛋白质相界面沉淀；当Na2HPO4浓度为18%时，萃取效果最好，分配系数K、回收率Y和纯化倍数PF分别为8.25、87.5%和2.49。因此，确定双水相系统成相盐Na2HPO4的最佳浓度为18%。

表3 无机盐种类对木聚糖酶萃取的影响Table 3 Effect of salts on the extraction of alkaline xylanase

表4 Na2HPO4浓度对碱性木聚糖酶萃取效果的影响Table 4 Effect of Na2HPO4concentration on the extraction of alkaline xylanase

表5 NaCl浓度对碱性木聚糖酶萃取效果的影响Table 5 Effect of NaCl concentration on the extraction of alkaline xylanas

2.5 NaCl加入量的影响

不同电解质正负离子的分配系数不同，当双水相系统中含有这些电解质时，因为两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，此外，中性盐的 加 入 可 以 加 速 相 分 离 、改 变 蛋 白 质 的 疏 水 性[10]。NaCl是其中最常用的中性盐，目前已有大量通过加入NaCl改善双水相系统萃取效果的报道[13-14]。因此，本研究考察了NaCl加入量对萃取效果的影响，萃取 条 件 为 ：PEG 4000 浓 度 20% ，Na2HPO4浓 度 18% ，pH5.0，NaCl浓度0%~12%，结果列于表5中。

NaCl的加入对其指标的影响不明显（p＞0.05，结果未列出）；如表5所示，添加NaCl对萃取效果无强化作用，随着加入NaCl浓度的增加，萃取各项指标呈下降趋势。因此，确定萃取过程中不加入NaCl等中性盐。张兰威等[15]利用PEG1000/MgSO4双水相体系分离风干香肠中蛋白酶的研究中也得到同样的结果。

2.6 pH对萃取效果的影响

双水相体系的pH也是影响生物分子分配行为的重要因素。为了研究pH对毕赤酵母碱性木聚糖酶分离效果的影响，在上述优化的条件下，即：PEG 4000浓度20%，Na2HPO4浓度18%，不加入NaCl，将双水相体系的pH调至5.0~8.0范围内，研究pH对萃取效果的影响，结果列于表6中。

pH变化对相比的影响可以忽略不计（p＞0.05，结果未列出）；当pH为6.0时萃取效果最佳，分配系数K、酶活回收率Y和纯化倍数PF均达到最大，分别为8.51、87.2%和2.54倍；当pH高于6.0时，萃取效果明显下降。通常，pH通过改变目标蛋白质和杂质的带电性、离子组成和表面特性，影响其在上下相间的分配特性。此外，pH还可以改变双水相体系的离子组成[16]。许多利用双水相萃取技术分离酶分子的研究均发现pH对萃取效果有较大影响，且萃取有最适pH。本研究中，适合毕赤酵母碱性木聚糖酶萃取的最适pH为6.0。

表6 体系pH对木聚糖酶萃取的影响Table 6 Effect of pH on the extraction of alkaline xylanas

3 结论

通过考察双水相体系萃取毕赤酵母碱性木聚糖酶的条件，确定最佳成相聚合物是PEG 4000，浓度为20%，最佳成相盐是Na2HPO4，最适浓度为18%，最适pH为pH6.0，萃取过程中不需要加入中性盐NaCl，在此条件下，最佳萃取结果为：分配系数K为8.51，酶的活力回收率Y为87.2%，纯化倍数PF为2.54。

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Separation of alkaline xylanase from Pichia pastoris using aqueous two-phase extraction

Aqueous two-phase system was used to separate alkaline xylanase from recombinant Pichia pastoris. The effects of molecular weight of the PEG，PEG concentration，phase forming salts，salt concentration，neutral salt（NaCl） concentration and pH on enzyme partitioning and purification were investigated.The results showed that PEG 4000 concentration 20% ，disodium hydrogen phosphate concentration 18% ，without NaCl，under the condition of pH6.0 were the optimal conditions.And the best results were achieved as follows：partition coefficient（K） 8.51，enzyme activity recovery（Y） 87.2%and the purification factor（PF） 2.54.

aqueous two-phase extraction；alkaline xylanase；separation

Q814.1

A

1002-0306（2014）22-0172-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.029

2014－01－06

郭金玲（1980-），女，博士，讲师，研究方向：生物催化与生物分离。

三峡大学人才科研启动金（KJ2010B033）。