袁 芳，符雨欣，黄 瑶，钟 梁，陆兆新，吕凤霞，赵海珍，别小妹

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏南京 210095）

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

袁 芳，符雨欣，黄 瑶，钟 梁，陆兆新，吕凤霞，赵海珍，别小妹*

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏南京 210095）

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株，在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上，将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明，当以0.6mol/L NaCl为高渗洗涤液，0.1mg/mL溶菌酶酶解40min后，涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上，原生质体形成率达到95.49%，再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件，融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产SubtilosinA菌株进行两轮全基因组改组，结合双亲灭活的筛选方法，挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264，产量达17.59mg/L，比出发菌株提高了3.58倍。

原生质体，基因组改组，稳定性

基因组改组技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，该技术比基因工程法操作简单，克服了传统育种法中种间、属间甚至远源亲本间实现杂交的障碍，能使遗传基因高频重组，并且双亲的优良性状集中的机会增大[1]。Hopwood等[2]提出，通过原生质体融合的过程可以实现隐性基因的重组暴露，使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型，成为育种的新途径。

SubtilosinA是1985年Babasaki等从枯草芽孢杆菌中提取出来的[3]，SubtilosinA能抑制多种G+细菌和一些G-细菌生长，对一些芽孢菌也有较好的抑制作用，如炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌[4]。此外还能抑制单核增生李斯特菌、藤黄微球菌、无乳链球菌、加德纳氏菌[4]等常见食品中的污染菌和一些病原菌以及能够杀灭疱疹病毒。SubtilosinA具有较好的稳定性，在100℃条件下1h以及pH2~10的范围内处理无任何活性损失[5]。

本实验室保藏了一株产SubtilosinA的枯草芽孢杆菌，但其产量较低。本研究在原生质体最佳形成、再生和融合的基础上，通过两轮基因组改组过程以期筛选出一株高产SubtilosinA且稳定遗传的菌株，为后续SubtilosinA的进一步的研究打好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Bacillus subtilis nja A1B2-2，nja 4-43，nja N2-99，nja Z1-53，nja H1-65 由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏；指示菌 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）CMCC 63202；NB 牛 肉 浸 膏 3g，鱼 粉蛋 白胨10g，NaCl 5g，琼脂1.8~2.0g，水 1000mL；LB 酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL；高渗液种类 高渗液A（SMM）：蔗糖171.5g/L，MgCl24.273g/L，顺丁烯二酸2.336g/L，双蒸水配制，pH6.5，115℃ 灭 菌30min；高 渗 液 B（高 盐）：含0.6mol/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液；改良的HM溶液（%）：NH4Cl 0.1，Tris 1.2，KCl 0.0035，NaCl 0.0058，Na2SO40.0132，MgCl2·5H2O 0.426，葡 萄糖0.2，蔗糖170.117，pH7.5，115℃，30min灭菌[6]；甘露醇培养基 0.5mol/L甘露醇，115℃，30min灭菌；再生培养基 上层：用不同高渗液配制的NB培养基，琼脂1.8%~2.0%，下层：0.8%的琼脂，其余同上；电击缓冲液 0.5mol/L甘露醇，0.5mol/L山梨醇，10%甘油[7]；溶菌酶液 用高渗溶液SMM配制溶菌酶液，浓度为50mg/mL，再用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌，分装成单次使用的小份，-20℃保存。

超净台 苏净集团安泰公司；OHAUS 2100 pH计 美国OHAUS公司；高压蒸气灭菌锅 日本TOMY公司；Agilent 1100 series高效液相色谱系统 美国Agilent公司；HYL-A全温摇瓶柜 太仓市强乐实验设备有限公司；飞鸽牌系列离心机 上海安亭科学仪器厂；全系列伯乐Bio-rad电穿孔仪 美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞悬浮液的制备 将出发菌株在NB斜面上37℃培养24h，取一环于LB培养基中，37℃ 180r/min培养19h后转接10%于另一瓶100mL新鲜LB培养基中培养14h至对数末期。

1.2.2 原生质体的制备与再生 取上述菌液5mL于离心管中，5000r/min离心20min收集菌体，将收集到的菌体用高渗液洗涤两次，并悬浮于等体积高渗体系中。取一定量的菌体稀释到10-4、10-5、10-6后涂布于再生培养基平板计数，得到菌落总数A。另取5mL菌悬液加入不同浓度的溶菌酶35℃水浴锅中酶解一定时间后迅速加入10倍体积高渗液稀释终止酶解反应，3000r/min离心17min去酶。取沉淀用生理盐水洗涤两次并重悬于等体积的生理盐水中，稀释合适倍数涂布双层再生平板得到未酶解的菌落总数B；另取沉淀用高渗溶液洗涤两次并重悬于等体积高渗液中，稀释合适的倍数后涂布双层再生平板得到再生平板上总的菌落数C。原生质体形成率和再生率的计算式为：

原生质体形成率（%）=（A-B）/A×100

原生质体再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100

其中：A-酶解前菌落总数；B-未被酶解的菌落数；C-再生培养基平板上的菌落总数。

1.2.3 原生质体灭活 取前期制备的原生质2mL于6cm小平板中，加入大头针，放置在超净台中的磁力搅拌器上，18W紫外灯下15cm照射一定时间后暗光操作，取100μL涂布双层再生平板。另取2mL原生质体悬液于灭菌的离心管中，100℃沸水浴中灭活一定时间后取100μL涂布双层再生平板，同时取未经任何处理的原生质体100μL涂布再生平板作对照，37℃培养36~48h后菌落计数，计算再生平板上未被灭活的菌落数。

1.2.4 原生质融合 在研究了相关文献[8-10]的基础上，本实验利用电穿孔仪对原生质体进行电融合操作。先取紫外灭活、热灭活两种不同方式灭活的原生质体各取1mL混匀，放置5min后3000r/min离心17min，用电极缓冲液洗涤2~3次后溶解在等体积的电极缓冲液中，取出100μL于电极杯中，先设定细胞排列成串条件：脉冲电压150V，脉冲宽电极缓冲液中，取100μL灭活的原生质体于2mm的电极杯中，设置原生质体排列条件为脉冲宽度100ms、脉冲个数9以及合适的脉冲电压和脉冲间隔，使原生质体排列成串。室温放置1min，进行原生质体电穿孔，电穿孔条件为脉冲间隔为5s、脉冲个数为2以及适合的脉冲电压和脉冲宽度。以上最优条件的选择均以原生质体融合率的高低进行比较。反应结束后，室温下放置15min，涂布双层再生平板并置于37℃培养箱培养36~48h。原生质体融合率计算公式如下：

其中：D-紫外灭活后再生平板上的菌落数；E-热灭活后再生平板上的菌落数；F-融合后再生平板上的总菌落数。

1.2.5 融合子的筛选 用灭菌的牙签从再生平板上挑选360株融合子点在LB固体培养基平板上培养24h后，用打孔器将菌圈周围的琼脂块打下，置于短小芽孢杆菌的指示菌平板上培养16~18h，挑选出抑菌圈较大的50株菌在LB中发酵24h，5000r/min将菌体离心，上清用HCl调pH至2.0，4℃放置隔夜，5000r/min离心去除上清，沉淀用甲醇浸提2~5h，过0.22μm滤膜后HPLC检测含量。

短小芽孢杆菌指示菌平板的制作：用接种环取短小芽孢杆菌于新鲜的NB斜面上，37℃活化24h。取5mL生理盐水于试管内，螺旋仪上振荡，将菌体洗下，调整菌浓度OD600=0.5，制成菌悬液。取灭过菌的双面板2块，倒入10mL 3%的琼脂作为底层。将上述菌悬液倒入55℃左右融化的NB培养基中，摇匀后取25mL加入上述琼脂底层，室温凝固后即为抑菌平板。

1.2.6 两轮基因组改组 将出发菌株nja A1B2-2，nja 4-43，nja N2-99，nja Z1-53，nja H1-65进行第一轮融合，并进行高产菌株的筛选，将第一轮筛选到的4株高产菌株进行第二轮融合。

1.2.7 高产菌株遗传稳定性实验 将筛到的高产菌株在NB平板上传代8代后，将1、2、4、6、8代分别接种在LB中发酵24h，发酵液处理过程同1.2.5，将甲醇浸提物过0.22μm滤膜后HPLC检测含量。

2 结果与分析

2.1 原生质体的制备与再生

2.1.1 洗涤高渗系统的筛选 原生质体酶解前后采用甘露醇、SMM和高盐三种高渗液洗涤菌体和原生质体，对比原生质体形成率和再生率的效果如图1所示。

由图1中可看出，三种洗涤高渗体系使原生质体的形成率均在90%以上，但以SMM为洗涤高渗体系时，再生率只有0.06%，以HM作为洗涤高渗液时的再生率为4.06%，而将高盐作为洗涤高渗液时，再生率达到34.1%。以盐溶液作为高渗洗涤体系的再生率要较糖和糖醇系统好，可能是脱壁后的原生质体在盐溶液系统中更容易保持形态的稳定，从而在再生培养基中更容易再生。

2.1.2 再生培养基高渗体系的筛选 将酶解后的原生质体涂布在以NB为基础培养基成分的培养基中，其中溶液体系分别换成甘露醇、SMM和高盐，考察再生培养基中高渗液体系对原生质体再生效果的影响，结果如图2所示。

图1 洗涤高渗液对原生质体形成和再生的影响Fig.1 Effect of the hypertonic solution for washing on protoplast formation and regeneration

图2 再生培养基高渗体系对原生质体再生的影响Fig.2 Effect of hyperosmotic solution in regeneration medium on protoplast regeneration

再生培养基中的营养成分对原生质体的再生具有较为显著的影响，适量的二价离子如Ca2+和Mg2+也能提高再生率。高渗液的种类也会影响原生质体的再生，对易于渗入质膜或被原生质体分解的物质不宜作为稳定剂。

通过改变再生培养基中高渗体系的种类以提高原生质体的再生率。由图2中可看出，当以洗涤高渗液高盐体系作为再生培养基的高渗体系时，再生率只有0.11%，以甘露醇为再生培养基的高渗体系时再生率则达到65.2%，但由于甘露醇成本较高，故本实验选择价格较廉的SMM作为再生培养基的高渗体系，其再生率为34.09%，可能是由于糖和糖醇体系对原生质体的保护作用，使得细胞壁更易于再生出来[11]。

2.1.3 溶菌酶浓度对原生质体形成率与再生率的影响 选择不同的溶菌酶浓度0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL分别酶解30min后涂布再生平板，原生质体的形成率和再生率见图3。

图3 溶菌酶浓度对原生质体形成和再生的影响Fig.3 Effect of lysozyme concentration on protoplast formation and regeneration

由图3可看出，Bacillus subtilis nja A1B2-2对溶菌酶较为敏感，随着溶菌酶溶度的增加，原生质体形成率均在90%以上，但再生率随着酶解时间的增加而逐渐降低，可能是高的溶菌酶浓度使原生质体脱水皱缩[12]影响了原生质体的再生。此外，破碎的细胞壁可作为原生质体再生的引物，酶解浓度过高使得细 胞 壁 脱 除 得 太 彻 底 ，也 不 利 于 再 生[13]。 故 选 择0.1mg/mL作为酶解浓度，再生率为32.5%。

2.1.4 酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响

用0.1mg/mL溶菌酶分别酶解不同时间，考察酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响，结果见图4。

图4 不同酶解时间对原生质体形成和再生的影响Fig.4 Effect of different enzymatic time on protoplast formation and regeneration

由图4可看出，当酶解40min时，原生质体再生率已达到89.25%，继续延长酶解时间后，再生率呈下降趋势，可能是较长的酶解作用使得细胞质体膜稳定性下降，导致原生质体破碎或活力的下降[14]，故选择40min为最佳酶解时间，此时原生质体形成率达到95.49%，再生率为89.25%。

2.2 原生质体的灭活条件

通过紫外灭活和热灭活的方式对融合子进行筛选，灭活结果如图5和图6所示。

紫外灭活原生质体与细胞内核酸的光化学变化有关，主要利用DNA中碱基形成的嘧啶二聚体以及DNA 的 解 螺 旋 作 用[15]；热 灭 活 主 要 使 核 糖 体 或 核 糖体RNA受到损伤，细胞内酶蛋白、功能蛋白的合成受到影响从而使细胞死亡[16]。

由图5和图6可看出，随着紫外灭活时间的延长，再生平板上再生长出的细菌数逐渐减少，当达到25min时，再生平板上已无菌体长出，故选择25min作为紫外灭活的时间；热灭活19min以后再生平板上已无菌长出，灭活时间继续延长会影响原生质体的再生效果，故选择19min作为热灭活时间。

表1 原生质体电穿孔条件Table 1 The best condition for protoplast electroporation

表2 原生质体排列成串条件Table 2 The best condition for protoplast arranged in clusters

图5 紫外灭活时间对原生质再生的影响Fig.5 The effect of UV inactivated time on protoplast regeneration

图6 热灭活时间对原生质体再生的影响Fig.6 The effect of heated-treat time on protoplast regeneration

2.3 原生质体电融合

2.3.1 原生质体电穿孔条件 设定细胞排列条件后，探索细胞穿孔的最佳条件，结果如表1所示。

由表1可看出，随着脉冲电压强度的增加，超过600V时，成串的细胞开始发生融合现象，但当电压超过1200V时，原生质体的融合率开始降低，可能是在较高的脉冲电压作用下，细胞发生裂解死亡[17-18]。脉冲宽度对融合率影响较为明显，当脉冲宽度较小，不足以使细胞膜穿孔发生融合，而脉冲宽度过大，细胞会发生不可逆穿孔，从而发生胞溶现象[19]。本实验中当脉冲宽度为0.5ms时融合率最高，达2.5×10-4。

2.3.2 原生质体排列条件优化 原生质体排列主要受脉冲电压和脉冲间隔两个参数影响，因此本研究对脉冲电压和脉冲间隔进行了优化，结果见表2。

电融合过程首先是利用高频交变电场使原生质体排列成串，本实验采用方波脉冲中较低的脉冲电压将原生质体排列成串。从表2可看出，脉冲电压在150V以上时，改变电压的条件会使得融合率降低，故选择150V脉冲电压，排列后的原生质融合率达到7.3×10-4。脉冲间隔偏低时，细胞成串效果不好，融合率较低，在1s时融合率最高，达到1.39×10-3，当超过1s时，融合率又开始下降，可能是对细胞产生了一定的损伤作用。

电融合法操作简单，融合效率高。但必须有专门的电融合仪来完成实验，本实验通过电穿孔仪实现了原生质体的融合过程。

2.4 两轮基因组改组

将四株出发菌株的原生质体进行第一轮基因组改组，筛选到了四株较高产SubtilosinA的菌株，结果见表3。

表3 第一轮基因组改组筛选高产SubtilosinA菌株Table 3 Selection for high-yield SubtilosinA strain from the first round of gene shuffling

第一轮基因组改组筛选到4株SubtilosinA产量较高的融合子，其中R1-68产量比出发菌株提高了3.5倍，在此基础上将第一轮筛选到的四株高产菌进行第二轮基因组改组，结果见表4。

表4 第二轮基因组改组筛选高产 SubtilosinA菌株Table 4 Selection for high-yield subtilosinA strain from the second round of gene shuffling

由表3和表4看出，第二轮改组产量增加的幅度已很低，只有一株菌R2-264的产量较第一轮筛选的R1-68的产量高6%，因此，本实验只进行了两轮基因组改组过程，其中第二轮中筛选到的融合子R2-264产量最高，达17.59mg/L。

2.5 高产菌株遗传稳定性实验

将筛到的高产菌株R2-264进行遗传稳定性实验，第1、2、4、6、8代SubtilosinA的产量如表5所示。由表5可看出融合子R2-264产SubtilosinA的遗传性状稳定。这也验证了全基因组改组技术所获的改组菌株能较好地保持了亲本的稳定性的特点。

表5 SubtilosinA高产菌株R2-264的遗传稳定性Table 5 The stability of high-yield SubtilosinA strain R2-264

3 结论

基因组改组技术因不受亲本菌株亲缘关系的限制，且可以较大幅度地将提高亲本基因间的重组频率从而能够集中优良基因等优点已成为目前工业微生物改良的重要方法之一。本实验将前期经过理化诱变得到的四株高产SubtilosinA菌株进行了两轮基因组改组，并筛选到一株比出发菌株R2-264产量提高3.58倍的融合子，其SubtilosinA产量达到17.59mg/L，且遗传稳定性良好，实验结果初步展现了全基因组改组技术在提高工业微生物发酵过程中次级代谢产物提高方面的显著作用。

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The breeding for high-yield subtilosina strain with genome shuffling

YUAN Fang，FU Yu-xin，HUANG Yao，ZHONG Liang，LU Zhao-xin，LV Feng-xia，ZHAO Hai-zhen，BIE Xiao-mei*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Bacillus subtilis nja A1B2-2 as the starting strain ， based on the optimum conditions for protoplast formation，regeneration and protoplasts fusion，genome shuffling was carried out between four mutant strains screened from phys-chem mutagenesis.The results showed when the hypertonic washing solution 0.6mol/L NaCl，0.1mg/mL lysozyme treating for 40min，spreading on gregeneration medium NB with hypertonic SMM，protoplast formation rate and the regeneration rate respectively reached 95.49%and 89.25%.After optimizing protoplast fusion conditions，its rate was up to 1.39 ×10-3.Then two round of genome shuffling was launched between four high-yield SubtilosinA strains.With the selection system of double inactivation of parental protoplasts，a stable and high-yield strain R2-264 was selected out with the maximum production of SubtilosinA at 17.59mg/L，which was 3.58 times higher than the starting strain.

protoplast；genome arrangement；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.028

2014－03－03

袁芳（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：微生物代谢与发酵工程。

* 通讯作者：别小妹（1964-），女，博士，博士生导师，研究方向：食品生物技术和食品微生物。