刘永峰，赵晓微，徐 阳，李蕊蕊（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

氯化钙与加热结合处理提取牛奶中cAMP的工艺研究

刘永峰，赵晓微，徐 阳，李蕊蕊（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

以牛奶为原料，离心去除牛奶中脂肪，采用不同浓度的氯化钙在不同加热条件下沉淀牛奶中蛋白质，再通过冷却结晶去除乳糖，分离提取牛奶中的环磷酸腺苷（cAMP），并采用高效液相色谱法定量测定所提取的cAMP含量，最后优化确定cAMP的最佳提取工艺条件。结果表明，不同CaCl2浓度处理牛奶时，0.8mg/mL浓度处理组较2.0mg/mL浓度组差异不显著（p＞0.05），但显著高于1.2mg/mL和1.6mg/mL两个浓度组（p＜0.05）；不同加热温度处理牛奶时，80℃处理组显著高于其他三组（p＜0.05）；综合两个因素时，1.6mg/mL浓度的CaCl2在80℃加热处理牛奶时cAMP含量为最高，达到（66.86±3.21）μg/mL。因此，牛奶中cAMP分离提取的最佳工艺条件为：加热处理温度80℃，CaCl2添加量1.6mg/mL。该工艺对于牛奶的综合利用、增加牛奶附加值等方面具有重要意义。

牛奶，环腺苷酸，氯化钙，加热，高效液相色谱

牛奶中含有丰富的营养物质[1]，其中的乳蛋白含有大量的赖氨酸和蛋氨酸，能补充谷类蛋白质的不足；乳脂肪以微粒状的脂肪球分散在乳浆中，更容易消化吸收；乳糖有调节胃酸、促进胃肠道蠕动和消化液分泌的作用；含有人体所需要的各种维生素和矿物质。除了这些主要的营养物质外，牛奶中还含有微量的生物活性物质如环磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’，5’-monophosphospate，cAMP）。cAMP溶于水，具有环状结构，对酸、碱、热都相当稳定，在人与哺乳动物体内，cAMP不仅参与机体多种酶的代谢过程，而且还可调节基因的表达，作为细胞的“第二信使”促进 mRNA的 转 录 ，影 响 蛋 白 质 合 成[2-3]。 人 体 内 缺 乏cAMP会导致恶性肿瘤、癌症、失眠健忘、贫血、心血管疾病等众多疾病的发生[4-5]；而且cAMP具有一定的药用价值，能作为某些药品（如环磷酸腺苷葡甲胺）的原料药[6-7]。

目前，从天然动植物资源中提取cAMP的研究不多，主要集中于枣果cAMP的分离提取。动物资源的研究中，仅有本实验室和马志科等做了阶段性工作[8-10]。本研究从牛奶中提取cAMP，对于牛奶的多元化综合利用具有重要意义。但是，要从牛奶中分离提取cAMP，必须要去掉其中的多种大分子营养物质，尤其是难以除去的蛋白质。在食品科学领域，氯化钙、热处理均是沉淀蛋白质的常用方法[11-12]，该方法在食品工业中安全性好，常被用于乳制品、黄酒等食品生产及水产品制品保藏[13-15]。综上所述，本研究采用氯化钙结合加热法对牛奶中的cAMP进行分离提取，通过HPLC测定牛奶中cAMP含量，以期建立一种高效的牛奶中cAMP分离提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛乳 购于陕西省西安市郊农户家中，于4℃度条件下冷藏保存，至实验使用；cAMP标准品 纯度≥99%，色谱纯，德国Sigma公司；甲醇 纯度为99.8%，色谱纯，加拿大Promptar公司；CaCl2、磺基水杨酸、磷酸二氢钾 均为分析纯。

高效液相色谱仪 美国Waters公司；色谱柱，HC-C18（5μm，4.6mm×250mm） 美 国Agilent公 司 ；TU-2000型紫外可见分光光度计 日本日立公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；D5-RZ型离心机型 湖南湘仪集团。

1.2 实验方法

1.2.1 样品去乳脂肪 将500mL鲜牛奶用纱布过滤，分装至48个离心管，每管10mL，预热至35~40℃，然后5000r/min，离心10min，让乳脂上浮，除去乳脂肪[8]。

1.2.2 样品去乳蛋白 将离心除去脂肪的牛奶分别加入0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的CaCl2，搅拌3min至混匀，每个处理浓度的样品分别放置在烘箱的70、80、85、90℃条件下加热，不同温度保持若干时间，使乳蛋白变性沉淀，过滤乳得到初滤液。

为探究出不同温度需要保持的时间，在过滤时取上清液1滴，放入黑色比色板孔中，加1滴20%磺基水杨酸[8]，如出现白色沉淀，证明还有蛋白质存在，继续加热除去，直到无白色沉淀为止，过滤，取上清液于48个离心管中。

1.2.3 样品去乳糖 将去脂肪、去蛋白后的滤液置于旋转蒸发仪中，75℃浓缩，将提取液浓缩到占初滤液体积1/10～1/15时，冷却浓缩液，边搅拌边冷却至20℃，保持数小时，然后放入4℃的冰箱过夜，形成乳糖结晶于容器底部。取上清液于离心管中，离心5min，弃去沉淀得到液体cAMP。

1.2.4 HPLC法测定cAMP 取cAMP标准品溶液，稀释1倍后，对其进行紫外全波长扫描，根据最大吸收率，确定检测波长为259nm。采用保留时间法[16]，在相同的色谱条件下，以待测物质的保留时间与标准品的保留时间相比对，相同的物质应具有相同的保留时间，如果保留时间不同则肯定不是相同物质，如此进行所要分析cAMP的定性。HPLC法测定牛奶中的cAMP色谱条件为[8-9]：色谱柱为C18，流动相为甲醇∶含0.05moL/L磷酸二氢钾的双蒸水（10∶90，V/V），流速为1mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL。

1.2.5 样品中cAMP含量的测定 研究设置4个氯化钙浓度水平，每次固定一个浓度水平，测其在四个不同温度条件下的CAMP值的平均值，研究设置4个加热温度水平，每次固定一个温度水平，测其在四个浓度条件下的CAMP值的平均值。共16个处理，每个处理3个重复。每个样品溶液过0.45μm滤膜，分别进样进行HPLC测定。

根据下式，计算出每个处理样品中cAMP的含量：cAMP含量（μg/mL）=cv/v1

式中：v为制备样品溶液浓缩后的体积，mL；c为HPLC测定样品溶液中cAMP浓度，μg/mL；v1为制备样品溶液所用牛奶的体积，mL。

1.2.6 统计分析 每个样品中cAMP含量在不同处理下分别计算，所有数据采用SPSS 18.0 软件进行单因素多水平方差分析，并进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 样品中cAMP的色谱图

cAMP标准品色谱图和样品cAMP色谱图分别为图1和图2。图1中cAMP标准品保留时间为3.389min，所有样品中cAMP保留时间与cAMP标准品的保留时间一致，如图2中样品溶液cAMP保留时间为3.395min。并且样品中的cAMP峰与其他峰的分离效果都较好。

图1 cAMP标准品溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of cAMP standard solution

图2 样品溶液中cAMP的色谱图Fig.2 Chromatogram of cAMP sample solution

2.2 样品中cAMP含量的测定

牛奶样品中cAMP含量的测定结果见图3。四个浓 度 氯 化 钙 处 理 组 之 间 比 较 ，0.8mg/mL 处 理 组（47.49μg/mL）较 1.2mg/mL 处 理 组（26.09μg/mL）和1.6mg/mL处理组（24.88μg/mL）的cAMP含量差异显著（p＜0.05），较2.0mg/mL处理组（31.19μg/mL）差异不显著（p＞0.05）；说明氯化钙的浓度对于从牛奶中分离提取cAMP的影响明显，可能通过影响蛋白质的沉淀量，从而间接影响提取物中cAMP的含量。

四 个 加 热 温 度 组 之 间 比 较 ，80℃ 处 理 组（61.35μg/mL）较其他三组cAMP含量差异显著（p＜0.05），其他三组之间差异不显著（p＞0.05）；说明热处理温度对于牛奶中cAMP的分离提取也有非常明显的影响，有可能通过影响蛋白质沉淀以及破坏cAMP结构两个方面，从而影响了提取物中cAMP的含量。

不同氯化钙浓度及不同加热温度组之间相比，总体差异较大。其中，0.8、1.6、1.2及2.0mg/mL的氯化钙浓度在80℃加热处理时，cAMP含量较高（p＜0.05），尤其以1.6mg/mL氯化钙添加量在80℃加热处理时为最高，达到（66.86±3.21）μg/mL。因此，牛奶中cAMP分离提取时，应选择的最佳条件为：热处理温度为80℃，CaCl2浓度为1.6mg/mL。

图3 牛奶样品中cAMP含量测定结果图Fig.3 Results of cAMP content in milk samples

3 讨论

cAMP作为细胞的第二信使，来源广泛，存在于所有动物、植物及微生物体内。近年来，不少学者对cAMP的提取技术和测定方法进行了积极的探索和研究，发现获取cAMP的方法一般有化学合成法、微生物发酵法和天然产物提取法[17]。目前，cAMP产品的制备主要采用化学合成法，并以核糖核酸为主要生产原料，制备工艺中使用的吡啶等化学物质，对人体有毒害作用，其残留物会对环境造成一定污染[18]。其次，微生物发酵法生产cAMP存在培养周期长，产物不纯，产物中可能含有微生物代谢产物等问题[19]，因此，利用动、植物组织为原料，从天然动植物中提取cAMP已成为cAMP提取的主要发展方向[20]。

利用植物组织为原料提取和检测cAMP的研究较多围绕枣开展。刘孟军等首次在14中园艺作物中成功检测出了cAMP[21]；张岩等用HPLC测定浓缩枣汁中 cAMP 含 量 为 4.56mmg/mL[22]，张 明 娟 等 用 HPLC 测定了8种枣果中cAMP的含量，含量最高为375.61μg/g，最低为46.01μg/g[23]；许牡丹等[24]在超声波辅助下提取枣粉中的环磷酸腺苷，并以HPLC定量测定cAMP的提 取 率 为154.3μg/g，王 春 霞 等[25]利 用 纳 膜 过 滤 后 浓缩、纯化得到cAMP成品；王立霞等[26]研究发现不同品种干枣枣皮cAMP含量不同，含量较高的新疆和田玉枣干枣皮cAMP含量为888μg/g，经工艺优化，提取率可以达到250μg/g枣粉。以上研究中，虽然从植物原料中成功提取或检测了cAMP，尤其是枣果内的cAMP最为丰富，但是提取物中cAMP含量低于部分多酚单体，不占有含量优势，且后期的分离纯化比较复杂。

利用动物性组织为原料提取和检测cAMP研究较少。马志科等[10]报道了从鲜羊奶中提取cAMP的方法，并利用放射免疫方法测定了cAMP含量，提取浓缩液浓度为6.58μg/mL。但是，羊奶中所提取的cAMP含量较低，没有应用HPLC方法去检测cAMP含量，所用放射免疫法存在危险性。另外，作者前期也采用三氯乙酸沉淀蛋白法辅助提取牛奶中cAMP，提取液中cAMP 含 量 为（29.02 ±1.58）μg/mL[8]，该 方 法 提 取 的cAMP含量虽然比羊奶中提取的高出3倍多，但是该含量远远低于本研究所提取的cAMP含量。

因此，在不断分析研究天然动植物中cAMP的分离提取方法的基础上，通过本次实验建立了一套基于氯化钙和加热处理的牛奶中cAMP提取工艺。该工艺的建立，为从乳酪副产物、乳清、不合格牛奶中提取cAMP提供了理论基础，从而将大大降低了cAMP生产成本，增加了产品的附加值。

4 结论

通过离心去除乳脂肪，采用不同浓度的CaCl2结合不同加热处理去除乳中的蛋白质，再通过低温静置沉淀除去乳糖，分离提取cAMP，并用HPLC法进行cAMP检测。最终得出牛奶中cAMP的最佳分离提取工艺条件为：热处理温度80℃，CaCl2添加量为1.6mg/mL。该工艺提取的cAMP含量为（66.86± 3.21）μg/mL。

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Study on the extraction technology of cAMP combined calcium chloride and heating treatment in the milk

LIU Yong-feng，ZHAO Xiao-wei，XU Yang，LI Rui-rui
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Milk as raw material was centrifuged to remove the lipids and then precipitated the proteins by appending with different concentration of calcium chloride （CaCl2） in different heating conditions.After being eliminated the lactose by cooling crystallization ，cyclic adenosine phosphate （cAMP ） extracted from milk was detected by high performance liquid chromatography （ HPLC ） .Finally ， the optimization condition of cAMP extraction technology was determined.As the results showed，comparing with the cAMP concentration dealed with different CaCl2concentrations there was no significant difference between the 0.8mg/mL CaCl2samples and 2.0mg/mL （p＞0.05 ） samples.However，the cAMP concentration of 0.8mg/mL CaCl2samples was higher than that of the 1.2mg/mL and 1.6mg/mL CaCl2samples （p ＜0.05 ）.While considering the heating effect on cAMP concentration ，the 80℃ group showed the higher production than the other three groups （p ＜0.05 ）.In combination with the two factors referred before，the optimal technique process was the 1.6mg/mL CaCl2with 80℃ ，so the cAMP concentration could reach as much as （66.86 ±3.21 ） μg/mL.Therefore ，we could get the optimum condition of the extraction and isolation of cAMP from milk：1.6mg/mL CaCl2，80℃ .This process was great significance for milk comprehensive utilization as well as increasing the added values of milk.

milk；cyclic nucleotide；calcium chloride；heating；HPLC

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0145-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.023

2014－03－03

刘永峰（1981-），男，博士，副教授，主要从事食品生物技术及营养学方面的研究。

陕西省科技计划项目（2012NY2-17，2014KJXX-51）；大学生创新创业训练计划项目（cx13065）。