于 佳(综述)，罗心平，倪唤春(审校)

(复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040)

组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)2最初被称为胎盘蛋白5，是近来发现的一类丝氨酸蛋白酶抑制剂[1]。1979年，Jandial等[2]首次在双胞胎妊娠者体内发现该蛋白并将其命名为胎盘蛋白5[2]，后来研究发现胎盘蛋白5与TFPI的氨基酸序列具有高度同源性,且两者性质具有一定相似性，故最终命名为TFPI-2[3]。TFPI-2参与调控组织因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的功能，影响粥样硬化斑块稳定性，该文就TFPI-2对动脉粥样硬化斑块不稳定相关因素作用的研究进展予以综述。

1 TFPI-2的体内表达及分布

人TFPI-2基因位于染色体7q22，全长约7 kb，包括5′非编码区、结构基因和3′非编码区，5′非编码区含有多个顺式作用元件，结构基因含有5个外显子和4个内含子，内含子和外显子之间的交界处遵循GT-AG规律(是指在内含子和外显子交界处有两个相当短的保守序列：5′端为GT,3′端为AG)[4]。TFPI-2基因的启动子区域富含GC，缺乏典型的TATA和CAAT盒，3个转录起始点已被识别[5]。TFPI-2基因的启动子保持持家基因的典型特点，Hubé等[6]发现，TFPI-2基因的启动子内核因子1、核因子κB和egr-1/Sp1结合位点高度保守，推测对TPFI-2的诱导性表达调控具有重要作用。

TFPI-2广泛分布于人体组织，包括胎盘、肝脏、骨骼肌、心脏、肾脏和胰腺等。多种细胞可合成分泌TFPI-2，包括内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、胎盘滋养层细胞等，内皮细胞合成的60%～90%TFPI-2直接分泌至细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。

TFPI-2在动脉粥样硬化组织中表达量增加。Crawley等[7]发现在正常人血管内，TFPI-2仅表达于血管内皮，而在动脉粥样硬化组织中，TFPI-2表达于巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞和VSMC，培养人主动脉VSMC、U937细胞(单核细胞)和Jurkat细胞株可获得TFPI-2进一步明确以上结论。

TFPI-2同时存在于细胞核和细胞质内，亦可能在细胞核内发挥作用。Kempaiah等[8-9]发现外源性和内源性TFPI-2均可在核转运蛋白作用下进入细胞质和细胞核，进一步研究发现在TFPI-2的191～211残基间存在二连核定位信号序列，推测TFPI-2通过核定位信号与输入蛋白α形成胞质复合体后与输入蛋白β相互作用，输入蛋白β作为分子伴侣协助三元复合体通过核孔复合体进入细胞核，提示TFPI-2可能在细胞核内发挥功能。

2 TFPI-2抑制体内蛋白酶的结构基础

TFPI-2是一类Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，相对分子质量为32×103，由235个氨基酸组成。TFPI-2蛋白结构包括短N端、3个串联Kunitz结构域(KD)、富含基本氨基酸的C端。KD1可抑制多种丝氨酸蛋白酶活性，包括组织因子/FⅦa复合体、TⅪa、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽释放酶以及纤溶酶等，该蛋白酶的选择性抑制作用通过精氨酸残基(R24)实现，R24组成的P1残基是以上蛋白酶的识别位点[10-11]。KD1对纤溶酶的抑制作用特异性差，KD1在抑制内源性凝血途径和外源性凝血途径的同时也能抑制纤溶酶，其抗凝血作用减弱抗纤溶作用，如果将KD1的Leu-17残基改为Arg后，其抗纤溶作用增强但不再具有抗促凝作用[12]。KD2亦参与纤溶酶活性抑制过程，研究发现在动脉粥样硬化病变处，TFPI-2、高分子量缓激肽、激肽原结合蛋白(gC1Qr/p33)的分布相似，gC1Qr/p33参与凝血等过程，提示TFPI-2依赖KD2与gC1Qr/p33形成特异性结合从而减弱TFPI-2对纤溶酶活性的抑制作用[13]。此外，KD2对FⅩa活性亦有抑制作用。KD3参与结合脂蛋白，形成游离TFPI-2，具有肝素结合位点，对肝素钙具有活性，可结合蛋白S，增强对FⅩa的抑制作用[14]。C端具有糖基磷脂酰肌醇锚定位点，以直接糖基磷脂酰肌醇介导的膜锚定方式在细胞表面定位[15-16]。

3 TFPI-2对动脉粥样硬化斑块不稳定相关因素的影响

动脉粥样硬化不稳定斑块以巨大脂质核心、炎性细胞聚集、薄的纤维帽为特征。随着斑块炎症的进展，MMP引起的凋亡和基质降解的作用突出，病变内坏死物质堆积、炎性纤维帽变薄，斑块炎症还造成氧化损伤增加。缺氧诱导斑块内微血管的病理性增生，导致外膜微血管延伸通过中膜直至斑块，这些新生病理性微血管构成的内皮完整性很容易受破坏后形成外漏和斑块内出血，斑块内凝血酶原激活物形成、凝血瀑布启动，进而斑块稳定性下降。由此可见，内皮细胞及巨噬细胞的功能、VSMC增殖状况、MMP及凝血酶活性是动脉粥样硬化斑块不稳定的重要相关因素。TFPI-2对纤溶酶、血浆激肽释放酶、MMP、组织因子/FⅦa复合体、FⅨa、组织蛋白酶G等具有较强的抑制作用，已有不少文献研究TFPI-2在动脉粥样硬化过程中的作用。

3.1TFPI-2与基质金属蛋白酶 MMP是一类Zn2+依赖性蛋白内肽酶，以酶原形式分泌，经其他丝氨酸蛋白酶，如纤溶酶激活后具有降解ECM蛋白的作用，与血管重塑过程保持协调，MMP系统失调控是斑块破裂的重要因素之一。MMP家族包含25个酶，具有不同底物活性。病理学研究显示间质胶原酶，即MMP-1在动脉粥样硬化斑块的纤维帽和肩部区域大量表达[17]。溶基质蛋白酶1，即MMP-3作用底物广泛，被认为是其他MMP家族成员的上游活化剂，免疫组织化学分析显示MMP-3对VSMC增殖和结缔组织重塑过程非常重要，与动脉粥样硬化和斑块破裂相关[18]。明胶酶B，即MMP-9具有降解Ⅳ型胶原活性，促使VSMC迁移，MMP-9在动脉粥样硬化斑块破裂处高度表达。动脉粥样硬化斑块内的各种细胞尤其是转化为合成型的VSMC表达多种MMP，如MMP-1、-2、-3、-9、-14等，而TFPI-2原位表达与MMP水平呈负相关。

TPIF-2间接调控MMP活化。Rao等[19]发现TFPI-2可抑制纤溶酶和胰蛋白酶，将相对分子质量为53×103的proMMP-1转化为部分活化型43×103的多肽、将相对分子质量为66×103的proMMP-3转化为活化型45×103多肽的过程，实现间接调控MMP-1和MMP-3催化基质的酶解。Du等[20]研究TFPI-2抑制MMP的结构区域，免疫沉淀和配体印记结果显示，TFPI-2并不能与MMP-2、-9、-1和活化MMP-1形成双分子复合物，TFPI-2对活化MMP-1酶解三螺旋胶原的活性没有影响，提示在体内TFPI-2可能不是直接调控MMP-1介导的ECM降解，而是调控胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活化proMMP的过程。

TFPI-2直接抑制MMP活性。Herman等[21]研究证实，TFPI-2是MMP抑制剂，强烈抑制MMP-1和MMP-13降解三螺旋胶原的活性，而三螺旋胶原是动脉粥样硬化斑块ECM的主要承载分子，TFPI-2对MMP-2和MMP-9活性也有弱抑制作用。Zhao等[22]发现，TFPI-2过表达可抑制人源氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导MMP-2、-9活性。Pan等[23]研究apoE-/-小鼠发现，TFPI-2过表达可抑制MMP以提供动脉粥样硬化斑块稳定性。

3.2TFPI-2与凝血酶 凝血酶是专一性很强的丝氨酸蛋白质水解酶，可直接催化纤维蛋白原为纤维蛋白，激活血管内皮细胞释放MMP和表达黏附分子，刺激VSMC增生和迁移，造成内皮功能紊乱，凝血系统活性增加，纤维蛋白溶解系统活性降低，血管性血友病因子、组织因子等促凝活性物质过度激活，血液处于高凝状态，增加血栓形成危险，促进动脉粥样硬化形成和斑块不稳定。

凝血酶上调TFPI-2表达，但其具体机制尚未明确。Neaud等[24]发现凝血酶通过环加氧酶2依赖、上皮生长因子受体非依赖介导机制，上调TFPI-2的mRNA和蛋白表达。Pou等[25]研究发现，凝血酶诱导THP-1巨噬细胞和人单核细胞来源巨噬细胞的TFPI-2表达增加1.9倍和2.3倍，同时胞外信号调节激酶1/2和c-Jun氨基端激酶磷酰化和IκB水平增加，结合已知TFPI-2基因启动子区域具有核因子κB结合位点，IκB磷酰化经IκB催化，IκB激酶可由胞外信号调节激酶1等多个激酶激活，因此推测，凝血酶通过磷酰化胞外信号调节激酶1/2和c-Jun氨基端激酶最终激活核因子κB的途径诱导TFPI-2表达，同时研究结果不支持表皮生长因子、转录因子激活子蛋白1、环加氧酶2参与作用机制。凝血酶生成增加可能是动脉粥样硬化严重的标志。Borissoff等[26]研究显示，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者体内凝血酶-抗凝血酶复合物血浆水平显著升高，体内凝血酶生成与动脉粥样硬化严重度之间具有独立相关性，提示凝血酶在动脉粥样硬化进程中可能起作用。

3.3TFPI-2与脂蛋白 高水平LDL、低水平HDL是形成动脉粥样硬化斑块的危险因素之一，在动脉粥样硬化进程中ox-LDL集聚是一个重要步骤。Llaverias等[27]发现家族性混合型高脂血症患者单核细胞内TFPI-2表达升高，推测TFPI-2表达受HDL水平调控，极低密度脂蛋白过度生成和血浆高水平是该病的主要特点之一，但是进一步研究发现极低密度脂蛋白并不能诱导巨噬细胞表达TFPI-2。Zhao等[22]研究显示，ox-LDL可下调VSMC的TFPI-2表达，造成不利斑块稳定环境。

3.4TFPI-2与血管平滑肌细胞 动脉粥样硬化斑块处大量VSMC活化并合成基质，分布于VSMC的TFPI-2更受关注。TFPI-2调控VSMC的增殖和迁移。Shinoda等[28]发现，TFPI-2诱导VSMC增生和形态学改变，提出TFPI-2是VSMC的促细胞分裂剂。Zhao等[22]发现，TFPI-2过表达可强烈抑制VSMC的增殖和迁移，推测可能与其作为丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制MMP-2、-9的活性相关，也可能通过对细胞周期蛋白D1及细胞增殖迁移相关信号转导通路丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、黏着斑激酶、STATS磷酸化的抑制。

TFPI-2对VSMC的作用受流体应切力影响。Ekstrand等[29]研究显示，鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜内的VSMC暴露于流体应切力环境时，VSMC同时表达TFPI-2和胱天蛋白酶3，TFPI-2的mRNA和蛋白表达量增加，推测流体应切力影响VSMC基因表达从而抑制增殖和诱导凋亡，通过调控VSMC增殖存活来参与修复血管壁。

3.5TFPI-2与内皮细胞 血管新生时ECM的重塑主要通过细胞周围纤溶酶依赖性蛋白酶解和MMP作用，内皮细胞表达的TFPI-2在ECM内显著分布，可抑制纤溶酶和MMP活性。TFPI-2抑制血管新生。Xu等[30]研究TFPI-2在内皮细胞内的表达调控以及对内皮细胞功能的调控，发现血管内皮生长因子以丝裂原-细胞外激酶依赖的方式诱导内皮细胞表达TFPI-2的mRNA和蛋白，进一步发现重组TFPI-2可抑制血管内皮细胞生长因子诱导内皮细胞增殖和迁移的作用，重组KD1可抑制血管内皮生长因子诱导的迁移但对血管内皮细胞生长因子诱导的增殖无抑制作用，TFPI-2可抑制血管内皮生长因子诱导的胞外信号调节激酶和Akt的活化，这些结果提示了TFPI-2通过直接抑制内皮细胞起到抗血管形成的作用，是TFPI-2对血管新生疾病的潜在治疗作用机制。TFPI-2抑制内皮细胞迁移。Ivanciu等[31]研究TFPI-2表达对内皮细胞迁移和血管发生的作用，发现迁移中的内皮细胞表达更多TFPI-2的mRNA和蛋白，另外腺病毒介导的TFPI-2过表达可减少新生血管形成、促进ECM降解和促进凋亡，同时纤维蛋白原缺如，推测TFPI-2通过抑制纤溶酶来抑制内皮细胞迁移。

3.6TFPI-2与巨噬细胞 巨噬细胞不断吞噬ox-LDL后最终变为泡沫细胞，并产生一系列趋化分子等募集更多炎性细胞，加速动脉粥样硬化发展。TFPI-2促进巨噬细胞细胞凋亡。凝血酶等刺激因素可促进巨噬细胞的TFPI-2表达量增加，而重组TFPI-2可通过Fas/FasL信号通路促使U937来源巨噬细胞的凋亡，提示TFPI-2可能具有抗致动脉粥样硬化作用[25,32]。

4 小 结

TFPI-2是一类相对分子质量为32×103的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，表达于内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞，在动脉粥样硬化斑块处高度分布。TFPI-2抑制MMP活性，使其无法水解胞外基质中的大分子物质，减少胞外基质降解，因此TFPI-2作为MMP内源性抑制物在维持和调节ECM重塑过程中起关键作用，具有稳定粥样硬化斑块的作用。此外，还抑制内皮细胞和血管平滑肌细胞等的增殖和迁移，促进巨噬细胞细胞凋亡，从而延缓动脉粥样硬化的进展，保护斑块稳定性。TFPI-2在动脉粥样硬化发展中的信号调控机制和功能研究日渐深入，必将展现广阔的临床应用前景。

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