张盼盼， 刘凤霞 综述 阿地力江·伊明 审校

(新疆医科大学基础医学院人体解剖学教研室， 乌鲁木齐 830011)

人类生殖能力呈逐年下降趋势，大约20%的育龄夫妇受到不育不孕的困扰，男性因素占到40%～60%，其中精子生成、成熟、输运异常是男性不育最常见的原因[1-2]。而且研究发现无精症(Azoospermia)、弱精症(Asthenospermia)和少弱精症(Oligoasthenospermia)与不育高度相关[3]。

少精症是指禁欲2～7 d精子密度<20×109/L。轻度少精症：精子密度(10～20)×109/L；中度少精症：精子密度5～10×109/L；重度少精症：精子密度<5×109/L。弱精症是指禁欲2～7 d具有快速向前运动的精子A级和缓慢向前运动的精子B级总和(A级+B级)<50%或A级精子<25%；轻度弱精症：A级+B级=30%～50%，或A级<25%；中度弱精症：A级+B级=30%～50%，其中A级<10%；重度弱精症：A级+B级<30%，其中A级为零。无精症是指3次精液检查均无精子[4-5]。少弱精症发病原因主要包括遗传因素、性激素和精子相关基因突变、先天性输精管缺如、抗精子抗体、感染、内分泌因素、疾病、锌缺乏、环境、饮食和吸烟等。而且其机制复杂，主要涉及一氧化氮和超氧化物歧化酶、蛋白质酪氨酸磷酸化和膜流动性、离子通道、微量元素异常等，由于病因及机制的不确定性，治疗方法也就多种多样，疗效各异，主要有特异性治疗(内分泌治疗)、半特异性治疗(感染性不育和免疫性不育)、非特异性治疗(提高精子质量和活力)、酶制剂、抗氧化药物、手术治疗、辅助生殖技术和基因治疗等。随着体外受精-胚胎移植或卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)技术的发展，大多数少弱精症患者都能得到缓解和治愈，满足生育要求。但由于治疗费用高、耗时耗力，导致很多患者不愿意和不配合治疗。因此，少弱精症的发病机制还需进一步深入地研究，阐明其发生发展规律，并开发研制出疗效更好、使用更方便、价格更便宜并容易被大众认可和接受的防治方案。动物实验是常用的研究对象，建立具有良好稳定性、可靠性和科学性的少弱精症动物模型就显得尤为重要。目前少弱精症动物模型的制作多采用大鼠，其次为小鼠，亦有选用家兔及食蟹猴的报道[6]。本文就建立少弱精症动物模型的研究进展综述如下。

1 奥硝唑(Ornidazole,ORN)法

奥硝唑是一种5-硝基咪唑类衍生物，是继甲硝唑、替硝唑之后的第3代硝基咪唑类衍生物，临床上多用于治疗厌氧菌、阴道滴虫、阿米巴原虫等感染[7]。动物实验主要用于预防各种厌氧菌感染和抑制雄性大鼠的生殖功能。研究发现，奥硝唑可以可逆性抑制大鼠附睾精子活力，导致雄性大鼠不育[8]。国内相关研究也发现，应用奥硝唑400 mg·kg-1·d-1灌胃3～4 w时，可导致大鼠在10～14 d不育，并可在停药7 d后完全逆转，该剂量能显著降低精子活动力，但对精子密度无显著影响。应用奥硝唑800 mg·kg-1·d-1剂量时，精子活动力与精子密度显著降低[9-10]。奥硝唑的作用部位可能是在附睾，一方面是通过增加细胞脂质过氧化产物丙二醛，抑制附睾中的能量转换酶或非蛋白类物质，使精子细胞受损、活动力降低；另一方面通过其分子中的硝基在无氧环境中还原成氨基或通过自由基的形成，与细胞成分相互作用，从而导致精子细胞受损[11]。

2 腺嘌呤(Adenine)法

腺嘌呤灌胃或放入饲料，大鼠出现中医肾阳虚表现，且精子质量、性激素水平及睾丸组织结构发生改变，这些改变与人类肾阳虚不育相似[12-13]。腺嘌呤可直接降低17β-羟基类固醇脱氢酶活性，导致睾酮合成减少,或者通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统影响睾丸血液循环而损害性腺，而且可引起雄性大鼠睾丸间质细胞中转化生长因子-β、Smads蛋白表达异常，抑制生精作用。腺嘌呤还能引起睾丸萎缩、精曲小管退行性变、各级精细胞退化变性和数量减少、精子减少或缺如，同时精曲小管之间的结缔组织增多，间质细胞数量减少，且3β-羟基类固醇脱氢酶活性显著降低(此酶可将雄烯二酮还原为睾酮)，导致血中睾酮含量降低。黄天伦等[14]报道腺嘌呤在体内不仅可以通过黄嘌呤氧化酶(XOD)的作用生成2，8-二羟基腺嘌呤，也可通过XOD的作用生尿酸，产生高尿酸血症。XOD反应过程中产生大量氧自由基，引发精子膜上多聚不饱和脂肪酸发生脂类过氧化反应，使膜上出现流动性不同的多相区域，破坏精子细胞的脂质酸分子结构，导致膜的流动性、通透性改变，从而使精子数量减少、活力下降。葛争艳等[15]用0.5%羧甲基纤维素钠溶液按25 mg/mL浓度配制腺嘌呤，按0.1 mL/kg体质量连续灌胃大鼠20 d即可制备少弱精症大鼠模型。

3 雷公藤多甙(GTW)法

雷公藤多甙是一种免疫抑制药物，具有明显的抑精作用。童建孙等[16]进行的动物实验表明，雷公藤多甙灌服16 mg·kg-1·d-1，连续5 w后，精子密度及活率下降，畸形率增加，可损害睾丸组织，引起雄性动物血清睾酮、雌二醇下降，对睾丸生精上皮损伤的严重程度与投药剂量的大小和投药时间的长短成正比, 停药后生育力可迅速恢复。雷公藤多甙对大鼠生殖系统的靶细胞主要是生精细胞，精子细胞和精子受累最早，精母细胞次之，精原细胞敏感性最低；其机制可能与其诱导生精细胞凋亡相关，其能使睾丸内Bax、Fas、FasL和Caspase-3表达增加[17-18]；雷公藤多甙也可直接作用于变态期精子细胞内骨架系统的微管或纵形粗纤维以及肌动蛋白，导致出现大量头颈分离、断端颈部弯曲、头畸形及多尾畸形精子；妨碍了正常细胞的分裂过程，出现了核分裂而胞质不分裂的病理现象，最终导致精子生成障碍[19]。

4 环磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)法

环磷酰胺是临床上常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，应用环磷酰胺联合化疗方案中，精原细胞发育障碍并导致患者少精症、无精症[20]，而且具有浓度依赖性[21]，作用甚至长达0.5～10 a[22]。环磷酰胺生育毒性主要是对生精干细胞的破坏，其使精子细胞染色体易位、精母细胞DNA断裂，诱导生殖细胞遗传物突变或畸形[23]；通过激活p53及Fas/FasL等途径诱导生殖细胞凋亡[24]；还能抑制A型精原细胞标志物c-kit蛋白的表达，干扰A型精原细胞增殖分化功能[25]。灌胃给予CP 10 mg·kg-1·d-1，2 w后便可发现大鼠各级生精细胞数量显著减少，精子数量减少，精子活动能力下降[26]。

5 棉酚(Gossypol)法

乙酸棉酚50 mg/kg灌胃给药，3 d给药1次，连续5次，即可制备少弱精症大鼠模型[27]。靳国春等[28]用20 mg/kg喂养大鼠3个月，发现大鼠精子数量及精子活动率均显著下降，睾酮水平降低。或每天给予大鼠灌胃棉籽油6 mL/kg，连续14 d，大鼠精子密度、精子活动显著降低，血清LH及FSH明显下降[29]。棉酚主要损伤变态期精子细胞和中后期精母细胞，线粒体对棉酚最为敏感，是损伤最明显的靶细胞器之一[30]。雄鼠在摄用棉酚期间，先后发生精子活动度下降、附睾尾精子淤积、精子线粒体膜结构异常或丢失、胞浆膜及尾部微管结构损伤或丢失，继以精子发生障碍，前列腺分泌枸橼酸减少，睾丸及副性腺重量下降，睾丸三磷酸腺苷酶、丝氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、果糖酶、葡萄糖1、6-二磷酸酶活性下降。睾丸及副性腺对Zn2+摄入明显减少，以睾酮为底物的5α还原酶及3α羟类固醇脱氢酶活性显著降低[31]。

6 中医方法

中医在几千年前就把“恐”这一情志列入到了致病因素中。压力、恐惧是当前人类致病的一个重要的发病因素，对人体神经、内分泌等多个系统、多脏器都有一定的影响，因此也越来越引起人们的关注。根据“恐伤肾”原理，采用猫吓母鼠的方法，制备子代先天肾虚模型[32]，将孕鼠直接置于猫笼之下，猫笼与鼠笼仅一网之隔，猫爪可触及雌鼠，雌鼠惊恐不已，缩在角落，不吃不喝，每天上午、下午各恐吓2 h，共14 d，至孕鼠分娩前1 d为止。每次恐吓时给猫喂1～2只雄鼠或非实验鼠吃，以增加恐吓的气氛。子鼠睾丸HE染色发现，恐吓组曲细精管中生精细胞层数4～5层，生精细胞排列不整齐，分布多少不均，睾丸间质内明显水肿，并见多数生精细胞胞浆有空泡变性，在精曲小管管腔内出现少量散在巨噬细胞，个别形成多核巨细胞，管腔内精子生成明显减少，且分布不均。根据“外伤及肾”的原理，张庆彝等[33]用皮肤烧伤法制备肾虚模型，将电铬铁加热烧伤大鼠背部脊椎两侧皮肤约5 s，有效烧伤面积为1 cm×2 cm，每周烧伤3次，3 w后发现睾丸精曲小管生精上皮腐脱，精母细胞内大量空泡形成，胞核轻度浓缩，成熟精子明显减少，间质疏松，间质细胞胞浆浓缩。沈雁等[34]用老虎钳夹断小白鼠双侧股骨上端，造成人为骨折，而后每天扭折骨折处，以加重损伤，3 w后发现骨折组睾丸精曲小管上皮腐脱、结构紊乱及腔内成熟精子量减少明显，生精上皮层次减少及变性，精母细胞空泡形成量多。

7 维吾尔医方法

维吾尔医学为祖国传统医学的重要组成部分，其是以实践经验为主体、以整体治疗为特征的医学体系，具有良好的临床疗效和独特的理论内涵，在男科领域尤以疗效显著。近期阿地力江·伊明等[35-36]根据维医体液质论采取湿寒环境和湿寒饲料干预的方法成功建立了维医异常黏液质证候及阳痿病证大鼠模型，并发现证候及病证模型组大鼠睾丸组织中生精小管萎缩变形，管壁生精细胞数量明显少于正常对照组，管壁厚，管径小，基膜破损，生精上皮排列紊乱，生精细胞脱落、变性，间质细胞数量减少，同时发现其精子数量与活力显著性降低，由此为从病因学角度建立少弱精症动物模型开辟了一条新的思路。

8 其他方法

岳广平等[37]给成年大鼠每日肌注1次氢化可的松30 mg/kg，9 d后发现精子活动度下降，其机制可能是抑制垂体前叶促肾上腺皮质激素(ACTH)释放，使肾上腺皮质分泌类固醇激素减少。Li等[38]用43℃水浴局部温浴食蟹猴睾丸，发现可通过诱发生精子细胞凋亡导致精子数下降。另有关研究报道用4 mg/mL白消安，每只小鼠按40 mg/kg行腹腔内单次注射，也可制作少弱精症模型[39]。

综上所述，动物模型作为少弱精症发病机制和防治研究的基础，在少弱精症研究领域具有举足轻重的作用。每种模型的制备方法和机理都有所不同，而且存在着诸多局限，但在以往的研究中，动物模型仍然为少弱精症研究提供了大量有意义的基础数据。可以根据研究目的来选择不同少弱精症模动物型，而且在此基础上不断改进。因此，了解常用动物模型的特点，建立新的更有效的少弱精症动物模型是今后生殖医学工作者和该领域研究人员努力的方向之一。

参考文献：

[1] Camargo M, Intasqui P, Bruna de Lima C, et al. MALDI-TOF fingerprinting of seminal plasma lipids in the study of human male infertility[J]. Lipids, 2014, [Epub ahead of print].

[2] Aarabi M, Balakier H, Bashar S, et al. Sperm content of postacrosomal WW binding protein is related to fertilization outcomes in patients undergoing assisted reproductive technology[J]. Fertil Steril, 2014,[Epub ahead of print].

[3] Li W, Zhu W, Tang Z, et al. Semen quality of 16 835 infertile men in China[J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2014，39(2):157-160.

[4] 黄建喜,彭陈岑,阿周存,等.无精症少弱精症与生精障碍的研究进展[J].中国实用医药,2010, 5(16): 256-258.

[5] 郭应禄，胡礼泉．男科学[M]. 北京：人民卫生出版社，2005：28.

[6] 孙晓梅,陈瑜,李春花,等.食蟹猴少精弱精动物模型建立的研究[J].实验动物科学与管理,2006, 23(2): 22-25.

[7] 田怀平,王美纳.奥硝唑的药理作用及临床应用[J].中国医院用药评价与分析,2002,2(5):303-304.

[8] Zhang W, Liu QZ, Shang XJ, et al. L-carnitine improves the reproductive function of male rats with ornidazole-induced asthenospermia[J]. Zhonghua Nan Ke Xue，2009，15(7): 604-607.

[9] 庞雪冰,朱洋,李红钢,等.奥硝唑对大鼠精子的影响及作用机制探讨[J].中华男科学杂志,2005,11(1):26-28.

[10] 张稳,刘清珍,商学军,等.L-肉碱对奥硝唑所致弱精子症大鼠的治疗作用[J].中华男科学杂志,2009,15(7):604-607.

[11] Kamma JJ，Nakou M，Mitsis FJ．The clinical and microbiological effects of systemic omidazole in sites with and without subgingival debridemem in early onset periodontitis patients[J]．J Periodontol，2000,71(12)：1862-1873．

[12] Wang JH, Chen D, Wang L, et al. Regulatory effect of yijing fang on adenine-induced infertility in rat models: a pharmacodynamic study[J]. Zhonghua Nan Ke Xue,2013,19(9): 820-825.

[13] 马亮,刘华剑,南亚昀,等.金匮肾气丸对腺嘌呤致不育大鼠精子质量与肾脏功能的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(8):184-186.

[14] 黄天伦,夏明珠,任开明．腺嘌呤致雄性不育和慢性肾衰大鼠模型的相关性研究[J].中国男科学杂志,2003,17(3):171-173．

[15] 葛争艳,金龙,河福金.腺嘌呤致大鼠少精子症模型的实验研究[J].中国计划生育杂志,2009,17(11):659-672.

[16] 童建孙,许烨,张琢,等．雷公藤多甙对雄性大鼠抗生育作用的研究[J].中国药学杂志,1991,26(2):85-87．

[17] 张成,张春影,李彬彬,等.雷公藤多甙对大鼠精子凋亡的影响[J].中华男科学杂志,2010, 16(9): 786-789．

[18] 张才田.雷公藤多甙抑制大鼠精子发生及其机制的研究[D].南京：南京医科大学,2008.

[19] 张彬．雷公藤多苷(GTW)抗雄性生育活性的研究[J].中国现代医学杂志，2002,12(4):16-17．

[20] Gerres L ,Bramswig JH,Schlegel W ,et al .The effects of etoposife on testicular function in boys treated for Hodgkin's disease[J]. Cancer, 1998,83(10):2217-2222.

[21] Bokemeyer C ,Schmoll HJ,van Rhee J ,et al .Long-term gondal toxicity after therapy for Hodgkin's and non- Hodgkin's lymphoma[J].Ann Hematol，1994,68(3):105-110.

[22] Naccache P, Decaudin D, Koscielny S,et al. Semen preservation and gonadal toxicityin the treatment of non Hodgkin lymphoma Experience at the Gustave- Roussy Institute from 1980 to 1993[J].Bull Cancer,1996, 83: 307-314.

[23] Aguilar-Mahecha A，Hales BF,Robaire B．Effects of acute and chronic cyclophosphamide treatment on meiotic progression and the induction of DNA double-strand breaks in rat spermatocytes[J].Biol Reprod,2005，72(6):1297-1304．

[24] Brinkworth MH， Nieschlag E. Association of cyclophosphamide induced male-mediated,foetal abnormalities with reduced paternalgerm-cell apoptosis[J]. Mutat Res,2000,447(2):149-154．

[25] 何大维,李旭良,岳丽琴,等．环磷酰胺干扰精原干细胞功能的初步研究[J].中华男科学杂志,2006,12(5):387-390．

[26] 沈国球,潘铁军,鲁功成,等.环磷酰胺对雄性大鼠生精功能的影响[J].中华实验外科杂志, 2009,26(5):633-635.

[27] 倪崖,陈文颖,李春波,等.补肾强精颗粒剂的药效学研究[J].中国现代应用药学杂志,2006, 23(6):68-271.

[28] 靳国春,龚振岭,郝树亭,等．益精胶囊对雄性醋酸棉酚模型大鼠精子及其形态的影响[J].中国中医基础医学杂志,2002,8(4):44-45．

[29] 苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京：中医中医药出版社,1997：255.

[30] 王一飞.生殖医学[M].北京:人民卫生出版社,1991:404-405.

[31] Tres LL, Cahn F, Kierszenbaum AL. Permeable collagen-glycosaminoglycan cross-linked copolymers for the study of biological responses of cocultured sertoli and spermatogenic cells[J]. Cell Biol Toxicol,1992，8(3):61-71.

[32] 王米渠,丁维俊,曾祥国,等.造模先天肾虚证对子代鼠睾丸病理形态初报[J].浙江中医学院学报,1998,22(2):33-34.

[33] 张庆彝,张伟荣,匡调元,等.肾虚证的食疗研究[J].中国中医基础医学杂志,1996,1(4):20-21.

[34] 沈雁,匡调元,张伟荣,等.“外伤及肾”的实验研究[J].中西医结合杂志,1991,11(10):608.

[35] 阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生殖激素的改变及其生物学意义[J].新疆医科大学学报,2012,35(11):1438-1444.

[36] 阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证候与阳痿病证大鼠模型生精功能改变的研究[J].新疆医科大学学报,2012,35(11):1445-1449.

[37] 岳广平.艾灸对肾阳虚大鼠精子活动力的影响[J].中医研究,1990,3(2)：25-27．

[38] Li YC,Hu XQ，Liu YX,et a1．Afaf,anovel vesicle membrane protein, is rlated to acrosome formation in murine testis[J].Febs Lett,2006，580(17):4266-4273．

[39] 唐爱发,周永翠,余振东,等.Mm.158494基因在白消安引起的无精子症小鼠中的表达[J].中国男科学杂志,2008,22(9):1-4.