黄军凯， 张国珍

（中国农业大学植物病理学系，农业部植物病理学重点实验室，北京 100193）

炭疽菌属（Colletotrichu m）真菌寄主范围广泛，可以危害果树、农作物和花卉等［1－2］，引起多种植物的炭疽病。草莓炭疽病主要危害果实、根茎、叶片、匍匐茎、叶柄、花等，可导致果腐、根茎腐烂及整株萎蔫死亡、叶片、匍匐茎和叶柄的斑病及花枯［3］。以往报道，引起草莓炭疽病的病原菌主要有草莓炭疽菌（Colletotrichu m f r agariae）、胶 孢 炭 疽 菌 （C．gl oeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatu m）［3］。实际上，过去传统意义上的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌均为复合种，每一复合种内包含有多个种［4］。本实验室利用多基因系统发育分析的方法，对引起草莓炭疽病的病原菌进行了种的鉴定，发现国内草莓炭疽病菌的优势种为Colletotrichum theobromicol a（原来称为Colletotrichum f r agariae）（结果待发表）。

诱导真菌产生分生孢子是植物病原学研究、植物抗病性鉴定等工作中的重要环节。常规诱导分生孢子产生的方法有菌丝涂断、近紫外光照射、采用不同培养基或在培养基中添加植物组织、某种营养成分等［5－7］。

近年来随着草莓种植面积的扩大和种植年限的增加以及某些感病品种的推广，草莓炭疽病的发生在国内日趋严重［8］，科研单位和育种部门正加快草莓抗炭疽病的品种选育。如何通过人工培养，快速、大量获得炭疽病菌的分生孢子是获得有效接种体的重要保证。我们在进行草莓炭疽病菌的研究中，发现有些炭疽菌的菌株在PDA培养基上产孢少或产孢比较慢。在筛选草莓炭疽病菌的生防菌的过程中，把滤掉细菌的LB培养液添加到PDA培养基中，发现对炭疽菌分生孢子的产生有促进作用。为此，我们通过试验分析了LB培养基的主要成分中，究竟是酵母提取物还是胰蛋白胨对炭疽菌的产孢有促进作用，并确定了促进产孢成分的最佳用量。同时，还测定了涂断菌丝的方法是否对炭疽菌有促进产孢的作用。试验结果可为快速获得草莓炭疽病菌的大量分生孢子提供简便易行的方法和培养基。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用菌株分离自北京地区草莓炭疽病病样的根茎，经本实验室鉴定为C．theobromicol a，是草莓炭疽病菌中的优势种，所用菌株为C36。

1．2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨（T）10 g，酵母提取物（YE）5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，加水定容至1 L，用Na OH调节p H至7．4。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L。

PDA＋10%LB：1 L PDA培养基加入100 mL LB培养液。

PDA＋0．1%T：1 L PDA培养基加入1 g胰蛋白胨。

PDA＋0．05%YE、PDA＋0．1%YE和PDA＋0．5%YE：1 L PDA培养基分别加入0．5、1和5 g酵母提取物。

各培养基121℃灭菌20 min，备用。

1．3 试验方法

1．3．1 培养基对炭疽病菌生长的影响

将炭疽病菌菌株C36在PDA培养基上培养，待菌落长至培养皿近边缘时用打孔器（直径4 mm）在菌落边缘打取菌饼，分别接种到上述（1．2培养基）不同培养基平板（直径6 c m）中央，28℃，14 h光照条件下培养。培养3 d后测量菌落直径，观察并比较炭疽菌在不同培养基上的菌落特征和生长速度。以PDA培养基为对照。每处理重复3皿。

1．3．2 培养基对炭疽病菌产孢的影响

接菌方法和培养条件同1．3．1。培养5 d后，将整皿的分生孢子洗下，稀释成合适的孢子浓度，用血球计数板计数，并计算单位菌落面积的产孢量。以PDA培养基为对照。每处理重复3皿。

1．3．3 涂断气生菌丝对炭疽病菌分生孢子产生的影响

菌落生长3 d后，用无菌棉签将菌落上的气生菌丝涂断，继续培养2 d，洗下整皿的分生孢子，计数方法同1．3．2，以不涂断的处理为对照。每处理重复3皿。

1．4 数据处理

采用SPSS 17．0软件和Office Excel 2007软件对试验所得数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2．1 PDA中添加LB培养液及其主要成分对炭疽病菌生长和产孢的影响

在前期的其他试验中，我们偶然发现PDA培养基中添加一定量的LB培养液对草莓炭疽病菌有促进产孢的作用，为了明确LB培养液以及其中的哪种主要成分能够促进产孢，试验分别设置PDA中添加10%LB培养液、0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物，测定不同培养基对炭疽病菌生长和产孢的影响。

2．1．1 对菌落生长速度和菌落形态的影响

PDA培养基中添加10%LB培养液对菌落生长速度有一定影响，与对照相比菌落生长有所减慢，添加0．1%胰蛋白胨和0．05%酵母提取物对菌落生长速度均无显著影响（表1）。但从菌落特征来看，添加LB和酵母提取物处理的菌落中央出现较明显的肉粉色的产孢区（图1b），添加胰蛋白胨的则不明显，说明添加LB培养液促进产孢可能主要是酵母提取物的作用。

表1 PDA培养基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物对草莓炭疽病菌C36菌落生长速度的影响（3 d）1）Table 1 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）

图1 C．theobromicola C36在添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物的PDA培养基上的菌落特征（3 d）Fig．1 The colonies of C．theobromicola C36 on PDA media with LB，tr yptone and yeast extract，respectively（3 d）

2．1．2 对产孢量的影响

在PDA培养基中分别添加10%LB培养液和0．05%酵母提取物，培养3 d的菌株产孢量分别为15．51×104个／c m2和17．67×104个／c m2（图2），分别是对照产孢量的5．8倍和6．6倍。虽然添加胰蛋白胨的产孢量也高于对照，但明显低于添加酵母提取物的处理。结果表明，PDA中添加LB培养液促进炭疽病菌产孢，主要是酵母提取物的作用。

图2 PDA培养基中添加LB、胰蛋白胨和酵母提取物对C．theobromicola C36产孢量的影响（3 d）（P＜0．05）Fig．2 Effects of LB，tryptone and yeast extract added in PDA media on sporulation of C．theobro micol a C36（3 d）（P＜0．05）

2．2 酵母提取物添加量对炭疽病菌生长和产孢的影响

为了进一步确定促进分生孢子产生的酵母提取物的最适添加量，在上述添加0．05%酵母提取物的基础上，又分别设置了0．1%和0．5% 两个用量。

2．2．1 对菌落形态、菌落生长速度的影响

在PDA培养基中分别添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3个添加量中，随着酵母提取物添加量的增加，菌落生长速度有所减慢（表2），说明酵母提取物的浓度超过0．05%对菌落生长有一定抑制作用。随酵母提取物浓度的增加，菌落颜色变白，添加量为0．1%时菌落中央的肉粉色产孢区更明显，而添加量增加到0．5%时产孢区反而减小（图3）。因此，添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicola的产孢。

表2 PDA培养基中酵母提取物添加量对C．theobromicola C36菌落生长速度的影响（3 d）（P＜0．05）Table 2 Effects of the contents of yeast extract added in PDA media on colonial growth rate of C．theobromicola C36（3 d）（P＜0．05）

图3 C．theobr omicola C36在添加不同量酵母提取物的PDA培养基上的菌落特征（3 d）Fig．3 Colonies of C．theobr omicola C36 on PDA media with different contents of yeast extr act（3 d）

2．2．2 对产孢量的影响

在PDA培养基中分别添加0．05%、0．1%和0．5%酵母提取物的3个添加量中，以添加0．1%酵母提取物的产孢量最高，为42．41×104个／c m2（图4），表明PDA培养基中添加0．1%酵母提取物最有利于C．theobromicol a的分生孢子产生。

图4 PDA培养基中添加不同量的酵母提取物对C．theobr omicola C36产孢量的影响（3 d）（P＜0．05）Fig．4 Effects of different contents of yeast extract added in PDA media on spor ulation of C．theobr omicola

2．3 涂断菌丝对C．theobromicola产孢量的影响

菌株C36在培养基上培养3 d时，用无菌棉签将菌落表面的气生菌丝全部擦掉，再继续培养2 d后，可见培养基表面气生菌丝很少，布满一层肉粉色分生孢子（图5b1～b4），而在培养基上生长5 d未涂断菌丝的菌落气生菌丝茂密，只在菌落中央区域有产孢（图5a2～a4）。从图5还可以看出，不论是涂断还是未涂断菌丝的处理，添加酵母提取物后均比对照PDA培养基上的产孢区明显。

涂断菌丝后，在添加不同量酵母提取物的培养基上的产孢量都较未涂断菌丝的显著提高。在添加0．1%酵母提取物的培养基上未涂断菌丝的产孢量为57．91×104个／c m2，涂断菌丝后产孢量达101．24×104个／c m2，为前者的1．75倍；在添加0．5%酵母提取物的培养基上未涂断菌丝的产孢量为32．58×104个／c m2，涂断菌丝后产孢量达143．90×104个／cm2，为前者的4倍（图6）。试验结果也进一步印证了所观察到的肉粉色产孢区域大小和浓密与产孢多少直接相关，肉粉色区域越浓密，产孢量越大。由此可见，在PDA培养基中添加酵母提取物并结合菌丝涂断处理可使产孢量大大提高。

图5 未涂断菌丝培养5 d（a）与涂断菌丝2 d后（b）C．theobr omicola C36的菌落特征Fig．5 Colonies of C．theobr omicol a C36 gr owing 5 days with un－er ased aerial mycelia（a）and 2 days after the aerial mycelia erased（b）

未涂断菌丝的处理中，对照图4和图6中的结果，发现随培养时间的延长炭疽菌的产孢量有所增加，添加不同量的酵母提取物对产孢的影响是一致的，均为添加0．1%酵母提取物的产孢量最高。涂断菌丝的处理中，添加0．5%酵母提取物处理的产孢量最高，为143．90×104个／c m2，与未涂断菌丝的处理不完全一致，有可能与培养时间延长2 d或菌丝涂断作用有关。

图6 菌丝涂断处理对C．theobromicol a C36产孢量的影响（5 d）（P＜0．05）Fig．6 Effects of erasing aerial mycelia on sporulation of C．theobromicola C36（5 d）（P＜0．05）

3 小结与讨论

炭疽菌的人工培养通常采用PDA培养基，一般需要培养7 d左右才能产孢，产孢量也较少。本试验中，在PDA中添加0．1%的酵母提取物即可在培养3 d时得到大量的分生孢子，如果再结合涂断菌丝的方法继续培养2 d后，可使产孢量再提高2倍以上。本试验中诱发草莓炭疽病菌大量产孢的方法，将病原菌产孢对某种营养成分的需求与涂断菌丝刺激病原菌产孢两种方式结合起来，与以往报道的其他方法［5－7］有所不同。该方法对于草莓上其他种的炭疽菌也是适用的（数据未列出）。

据我们近几年对草莓病害的调查发现，在设施栽培草莓上，炭疽病的危害主要表现在定植期引起植株的枯萎死苗，造成严重缺苗和毁苗，损失严重。因此，加强对草莓炭疽病的抗病育种非常必要。而进行抗病品种的选育需要人工培养炭疽菌，以分生孢子作为接种体［8］。本试验发现的促进炭疽菌的产孢方法，培养3～5 d便可获得大量的分生孢子作为接种体使用。本研究中所用培养基的营养成分简单，促进产孢的操作简便，获得的分生孢子新鲜，菌龄一致，且产孢量大，非常适合相关科研单位进行抗病性鉴定时使用。

［1］ Sutton B C．The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichu m ［M］∥Bailey J A，Jeger M J．Colletotrichu m：biology，pat hology and control．Wallingford，CBC Inter national，1992：1－26．

［2］ Than P P，Jeewon R，Hyde K D，et al．Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with ant hracnose on chilli（Capsicu m spp．）in Thailand［J］．Plant Pat hology，2008，57：562－572．

［3］ 张云涛，张国珍主译．草莓病虫害概论［M］．第2版．北京：中国农业出版社，2012：42－82．

［4］ Cannon P F，Damm U，Johnston P R，et al．Colletotrichu mcurrent status and f ut ure directions［J］．Studies in Mycology，2012，73（1）：181－213．

［5］ 王静，任安芝，谢凤行，等．几种诱导黑麦草Loliumperenne L．内生真菌产孢的方法［J］．菌物学报，2005，24（4）：590－596．

［6］ 姚晟伟，谢悦，李兴红．葡萄溃疡病病菌（Botryosphaeria dothidea）的诱导产孢方法评价［J］．中外葡萄与葡萄酒，2011（5）：4－7．

［7］ 赵红，王彩霞，陈晓忍，等．苹果腐烂病菌诱导产孢方法［J］．中国农学通报，2012，28（10）：151－154．

［8］ 王丰，马跃，高秀岩，等．草莓品种对炭疽病抗性的鉴定技术研究［J］．果树学报，2008，25（4）：542－547．