陈怡等

摘要：基于分子印迹技术，以硫酸链霉素（STR）为模板分子，邻苯二胺（OPD）为功能单体，通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器，且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe（CN）6]为探针的方波伏安（SWV）分析，模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液，在此条件下制备的传感器性能良好。

关键词：硫酸链霉素； 邻苯二胺； 分子印迹； 电聚合； 电化学传感器

1引言

链霉素（Streptomycin）是一种氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性，广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中，临床上一般使用其硫酸盐。然而，链霉素具有肾毒性和耳毒性，能够引起过敏反应，滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1～4]。链霉素残留物主要存在于肉类，肝，肾，牛奶以及蜂蜜中。

目前，国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6，7]和仪器分析法[1，8，9]。微生物法所需设备简单，但不易筛选到特异敏感菌株，易受条件限制，灵敏度低；酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果，通常仅用于普通筛查；高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）等方法灵敏高。但是，链霉素缺少紫外吸收生色基团，往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测，操作繁琐、耗时长，而且大型设备的使用对操作人员要求较高，检测成本高[10]。

分子印迹聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11]，已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域，提供定量或半定量检测分析 [12～14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便，膜厚可控，特异性强，重现性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16，17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体，经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器，实验过程中无需对链霉素进行衍生处理，而是间接地通过电化学手段分析，操作简单快捷，特异性强，灵敏度较高，成本低，为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分

2.1仪器与试剂

LK2005A 型电化学工作站（天津市兰力科化学电子高技术有限公司）；三电极系统：玻碳电极（GCE，Φ=4 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂片电极为对电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸链霉素（Streptomycin sulfate，STR，纯度>99%，上海生工生物有限公司）；邻苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析纯，北京鼎国生物科技有限责任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析纯，天津市永大化学试剂开发中心）；其余试剂均为分析纯。

2.2玻碳电极预处理

将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V电位区间内， 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安（CV）扫描，待循环伏安响应稳定，氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV，电极预处理完成。

2.3分子印迹膜的制备

将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作为支持电解质），通纯N2 预聚合10 min后，在0～0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈，扫速为0.05 V/s。电极取出后，经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极（MIP/GCE）。非印迹聚合膜电极（NIP/GCE）的制备以同样的方法进行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印迹膜的洗脱

制备多支印迹及非印迹电极，分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟，取出后用二次蒸馏水淋洗5 min，以洗脱出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS缓冲液中洗脱，采用方波伏安法（SWV）比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同，但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致，会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差，洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe（CN）6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印迹技术，以硫酸链霉素（STR）为模板分子，邻苯二胺（OPD）为功能单体，通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器，且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe（CN）6]为探针的方波伏安（SWV）分析，模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液，在此条件下制备的传感器性能良好。

关键词：硫酸链霉素； 邻苯二胺； 分子印迹； 电聚合； 电化学传感器

1引言

链霉素（Streptomycin）是一种氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性，广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中，临床上一般使用其硫酸盐。然而，链霉素具有肾毒性和耳毒性，能够引起过敏反应，滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1～4]。链霉素残留物主要存在于肉类，肝，肾，牛奶以及蜂蜜中。

目前，国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6，7]和仪器分析法[1，8，9]。微生物法所需设备简单，但不易筛选到特异敏感菌株，易受条件限制，灵敏度低；酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果，通常仅用于普通筛查；高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）等方法灵敏高。但是，链霉素缺少紫外吸收生色基团，往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测，操作繁琐、耗时长，而且大型设备的使用对操作人员要求较高，检测成本高[10]。

分子印迹聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11]，已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域，提供定量或半定量检测分析 [12～14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便，膜厚可控，特异性强，重现性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16，17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体，经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器，实验过程中无需对链霉素进行衍生处理，而是间接地通过电化学手段分析，操作简单快捷，特异性强，灵敏度较高，成本低，为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分

2.1仪器与试剂

LK2005A 型电化学工作站（天津市兰力科化学电子高技术有限公司）；三电极系统：玻碳电极（GCE，Φ=4 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂片电极为对电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸链霉素（Streptomycin sulfate，STR，纯度>99%，上海生工生物有限公司）；邻苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析纯，北京鼎国生物科技有限责任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析纯，天津市永大化学试剂开发中心）；其余试剂均为分析纯。

2.2玻碳电极预处理

将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V电位区间内， 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安（CV）扫描，待循环伏安响应稳定，氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV，电极预处理完成。

2.3分子印迹膜的制备

将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作为支持电解质），通纯N2 预聚合10 min后，在0～0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈，扫速为0.05 V/s。电极取出后，经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极（MIP/GCE）。非印迹聚合膜电极（NIP/GCE）的制备以同样的方法进行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印迹膜的洗脱

制备多支印迹及非印迹电极，分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟，取出后用二次蒸馏水淋洗5 min，以洗脱出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS缓冲液中洗脱，采用方波伏安法（SWV）比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同，但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致，会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差，洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe（CN）6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印迹技术，以硫酸链霉素（STR）为模板分子，邻苯二胺（OPD）为功能单体，通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器，且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe（CN）6]为探针的方波伏安（SWV）分析，模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液，在此条件下制备的传感器性能良好。

关键词：硫酸链霉素； 邻苯二胺； 分子印迹； 电聚合； 电化学传感器

1引言

链霉素（Streptomycin）是一种氨基糖苷类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性，广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中，临床上一般使用其硫酸盐。然而，链霉素具有肾毒性和耳毒性，能够引起过敏反应，滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1～4]。链霉素残留物主要存在于肉类，肝，肾，牛奶以及蜂蜜中。

目前，国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6，7]和仪器分析法[1，8，9]。微生物法所需设备简单，但不易筛选到特异敏感菌株，易受条件限制，灵敏度低；酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果，通常仅用于普通筛查；高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）等方法灵敏高。但是，链霉素缺少紫外吸收生色基团，往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测，操作繁琐、耗时长，而且大型设备的使用对操作人员要求较高，检测成本高[10]。

分子印迹聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11]，已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域，提供定量或半定量检测分析 [12～14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便，膜厚可控，特异性强，重现性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16，17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体，经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器，实验过程中无需对链霉素进行衍生处理，而是间接地通过电化学手段分析，操作简单快捷，特异性强，灵敏度较高，成本低，为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分

2.1仪器与试剂

LK2005A 型电化学工作站（天津市兰力科化学电子高技术有限公司）；三电极系统：玻碳电极（GCE，Φ=4 mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂片电极为对电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸链霉素（Streptomycin sulfate，STR，纯度>99%，上海生工生物有限公司）；邻苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析纯，北京鼎国生物科技有限责任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析纯，天津市永大化学试剂开发中心）；其余试剂均为分析纯。

2.2玻碳电极预处理

将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V电位区间内， 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安（CV）扫描，待循环伏安响应稳定，氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV，电极预处理完成。

2.3分子印迹膜的制备

将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作为支持电解质），通纯N2 预聚合10 min后，在0～0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈，扫速为0.05 V/s。电极取出后，经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极（MIP/GCE）。非印迹聚合膜电极（NIP/GCE）的制备以同样的方法进行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印迹膜的洗脱

制备多支印迹及非印迹电极，分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟，取出后用二次蒸馏水淋洗5 min，以洗脱出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS缓冲液中洗脱，采用方波伏安法（SWV）比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同，但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致，会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差，洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe（CN）6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值（Δip）表征。