任 杰，胡志和，李金星

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134)

酪蛋白(casein，简称CN)，是在pH4.6、温度为20℃的条件下，从脱脂乳中沉淀下来的一种蛋白质［1－2］。它由乳腺上皮细胞合成，含有大量磷和钙，是哺乳动物奶中的主要蛋白质，约占乳蛋白的76%～86%，包括 αs1－酪蛋白、αs2－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白［3－4］。酪蛋白含有人体必需的8种氨基酸，能够与磷和钙结合，可以促进人体对钙磷离子的吸收，具有调节免疫的作用［5－7］。目前，国内外对酪蛋白的研究大多集中在具有特殊生理功能的酪蛋白水解物，即生物活性肽上，李伟等［8］和李荣华等［9］研究发现酪蛋白糖巨肽具有调节免疫的作用，彭登峰等［10］和杜军等［11］发现酪蛋白水解物可以抑菌，纪银莉等［12］研究表明酪蛋白水解物具有抗氧化的作用，张艳等［13］研究发现α－酪蛋白的水解产物可以降血压，Jolles等［14］研究发现酪蛋白水解物具有抗血栓作用，Noni［15］研究表明酪蛋白水解物可以调节肠胃吸收，而对于酪蛋白在胃液中消化情况的研究较少。由于牛初乳中酪蛋白含量较高，在胃中形成较大凝块，导致消化困难，特别是对新生儿，易造成消化不良。

超高压技术作为一种新型的非热杀菌技术［16］，它的优势在于，高压处理只作用于疏水键、氢键以及离子键等非共价键，对共价键无明显的影响，所以它不会破坏蛋白质等大分子物质的一级结构，但会改变其高级结构［17］，使组织发生变性，改善功能性质，如增强乳制品的吸光度和浊度［18］，提高蛋白质的可消化性。本实验以牛初乳为原料，通过模拟胃消化液对酪蛋白进行消化处理，旨在探讨不同的超高压处理条件对乳品中酪蛋白可消化性的影响，为乳品在人体内的消化情况的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳(产犊48h内) 由天津市武清区德兴隆奶业有限公司提供。

胃蛋白酶、β－酪蛋白标准品、L－酪氨酸 美国Sigma公司;甲醇(色谱纯级)、三氯乙酸 天津市科密欧化学试剂有限公司;盐酸、NaCl天津市化学试剂批发公司;NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3天津市赢达稀贵化学试剂厂;乳酸、乳酸钠 天津市光复精细化工研究所;酪素 天津市东方卫生材料厂。

HPP.L3－600/0.6超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司;BECKMAN COULTER毛细管电泳仪 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司;未涂层弹性石英毛细管 河北永年锐沣色谱器件有限公司;TU－1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SMART系列超纯水系统 上海康雷分析仪器有限公司。

1.2 样品的超高压处理

将生鲜牛初乳装于塑料袋内，真空密封后进行超高压处理，对照组样品为0.1MPa下的牛初乳。

1.2.1 不同的压力处理牛初乳 施压温度为30℃，保压时间为20m in，选取100、200、300、400、500和600MPa的压力条件处理牛初乳。

1.2.2 不同的施压温度处理牛初乳 处理压力为350MPa，保压时间为20m in，选取20、25、30、35和40℃的温度条件处理牛初乳。

1.2.3 不同的保压时间处理牛初乳 处理压力为350MPa，施压温度为30℃，分别选取10、20、30、40、50和60min的保压时间处理牛初乳。

1.2.4 高静压处理牛初乳的条件优化 选用处理压力、施压温度和保压时间作为实验因素，正交实验设计见表1。

表1 高静压处理牛初乳正交实验因素水平表Table1 The orthogonal factor－level design of high static pressure processing bovine colostrum

1.3 模拟胃消化液实验

将经过超高压处理后的牛初乳进行模拟胃液消化实验。

1.3.1 胃蛋白酶活力的测定 按照国标GB/T 23527－2009紫外分光光度法测定蛋白酶活力，配制L－酪氨酸标准溶液，浓度分别为0、10、20、30、40和50μg/m L，紫外分光光度计(275nm)测定其吸光度值，绘制L－酪氨酸溶液的标准曲线。另取试管吸取酶液2.00m L置于40℃的水浴中，2m in后加入已预热的酪素2.00m L，摇匀后置于40℃的水浴中反应2m in，加入4.00m L的三氯乙酸，摇匀后置于水浴锅中，10m in后过滤，取其上清液测其吸光度值。空白组加入的酪素和三氯乙酸顺序相反，其他一致。

式中:X－样品的酶活力，(U/mg);A－试样溶液的平均吸光度;K－吸光常数;8－反应试剂的总体积，m L;2－吸取酶液2.00m L;1/10－反应时间10m in，以1m in计;n－稀释倍数;1/C－吸取酶液的浓度，1mg/m L;E－紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白酶系数为0.77)。

1.3.2 模拟胃消化液的配制 称取0.2g氯化钠(NaCl)和Amg胃蛋白酶，加入70m L重蒸馏水，加入730μL盐酸，再用盐酸调 pH至 1.2，加水定容至100m L。现用现配。

根据公式:计算100m L模拟胃消化液中胃蛋白酶的添加量:

式中:A－胃蛋白酶添加量，单位为毫克(mg); B－胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克(U/mg)。

1.3.3 样品的可消化性处理 参照中华人民共和国国家标准农业部869号公告－2－2007“转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性实验方法”进行实验。在7m L离心管中加入1.9m L模拟胃消化液，37℃恒温水浴 5min。加入100μL样品蛋白溶液，迅速漩涡振荡并快速置于37℃水浴，准确记录时间，在每个反应时间点(0、2、30和60m in)，迅速吸取反应液200μL，加入1.5m L离心管中(含有70μL 0.2mol/L碳酸氢钠溶液)，冰浴、沸水浴各5min，取出后冷却至室温备用。

1.4 毛细管电泳条件

75μm×57cm i.d.未涂层弹性石英毛细管，缓冲溶液A为pH8.0磷酸盐缓冲液，分离电压25kV，检测波长214nm，操作温度25℃，以压力0.5psi进样，进样时间8s［19］。新装毛细管在使用前用甲醇(HPLC纯级)、0.1mol/L盐酸水溶液、1mol/L NaOH溶液、运行缓冲液A和重蒸水等进行预处理，每次进样前分别用1mol/L的NaOH、超纯水及分离缓冲液冲洗，以保证迁移时间和校正峰面积的重现性，实验所用溶液和样品液在使用前均用0.45μm微孔滤膜过滤［20－21］。

1.5 数据处理

数据分析和图表制作利用软件 SPSS和Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 胃蛋白酶活力的测定

由图1可以看出，L－酪氨酸溶液的标准曲线方程为:y=0.0075x－0.0056，相关系数R2=0.9993，标准曲线的相关性很好，结果准确性高，具有较高的可信度。根据回归方程，当吸光度值为1时酪氨酸的量为134.08μg，即吸光常数K值为134.08，在130～135范围内，结果可靠。

实验测得试样溶液的平均吸光度值为0.750，根据公式算得，样品的酶活力为1249U/mg，模拟胃消化液中胃蛋白酶的添加量为210.8mg。

2.2 毛细管电泳图谱

如图2，标准品的电泳谱图显示，β－酪蛋白在18m in出峰。毛细管电泳分离样品的原理是电泳迁移和电渗迁移，将样品引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分会形成电泳流和电渗流流向毛细管出口端，按分子量大小及其电荷大小的顺序依次通过检测器。其中 β－酪蛋白的分子量为24ku，αs1－酪蛋白的分子量为23.6ku，αs2－酪蛋白的分子量为25ku，酪蛋白各种亚类分子量接近，迁移时间相近，可以断定图中B、C、D在18m in出峰的物质为酪蛋白。对比图中B、C、D，经过消化处理后在18m in的峰面积明显减小，而9m in时的峰面积从无到有并逐渐增大，判断其为酪蛋白消化物。所以选择不同处理条件下9m in和18m in这两个迁移时间的峰进行比较。

图2 标准品和样品的毛细管电泳图Fig.2 Capillary electrophoretogram of standard and sample

图1 L－酪氨酸溶液的标准曲线Fig.1 The standard curve of L－Tyrosine solution

2.3 压力对牛初乳中酪蛋白模拟胃液可消化性的影响

当施压温度和保压时间固定为30℃和20min，分别选取100、200、300、400、500和600MPa的压力条件处理牛初乳，对处理后的样品进行模拟胃液的消化实验，再采用毛细管电泳仪对其进行检测。

图3中A、B分别为样品经模拟胃液消化后酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面积。由图3可以看出，牛初乳经过超高压处理以后，在所选压力范围内，模拟胃液消化时间越长，牛初乳中酪蛋白的峰面积越小，酪蛋白消化物的峰面积越大;当模拟胃液消化时间相同时，随着处理压强的增大，酪蛋白的峰面积逐渐减小，酪蛋白消化物的峰面积逐渐增大;当模拟胃液消化时间为60m in时，图3中A图的显著性分析结果显示只有处理压强为400MPa和500MPa时的结果没有显著性差异，其他处理条件之间均有显著性差异，而且从图中也可以明显看出，随着处理压强的增大，酪蛋白的峰面积在逐渐减小，与图3中B图随着处理压强的增大，酪蛋白消化物的峰面积在逐渐增大相一致，B图中显著性分析结果显示各个处理条件之间有显著性差异;当模拟胃液消化时间为30m in时，酪蛋白的峰面积在各个处理条件下的结果均有显著性差异，酪蛋白消化物的峰面积除处理压强为100MPa和200MPa时结果分析无显著性差异，其他处理条件下均有显著性差异;当模拟胃液消化时间为2min时，虽然在图中看不出明显变化，但显著性分析结果显示酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面积在不同处理压强下消化效果显著。

图330℃保压20min条件下不同压力处理牛初乳其酪蛋白可消化性的变化Fig.3 Digestibility change of casein at different pressure treatment bovine coloctrum with 30℃ for 20min

2.4 温度对牛初乳中酪蛋白模拟胃液可消化性的影响

当处理压强和保压时间固定为 350MPa和20m in，分别选取20、25、30、35和40℃的温度条件处理牛初乳，对处理后的样品进行模拟胃液的消化实验，再采用毛细管电泳仪对其进行检测。

图4中A、B分别为样品酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面积。由图4可以看出，当高静压处理条件一致时，酪蛋白的峰面积随着模拟胃液消化时间的增加而减小，酪蛋白消化物的峰面积变化则与之相反;当模拟胃液的消化时间固定时，在所选的温度范围内，施压温度越高，牛初乳中酪蛋白的峰面积越小，酪蛋白消化物的峰面积越大;当模拟胃液消化时间为2m in时，酪蛋白的峰面积除35℃与30℃和40℃的处理结果无显著性差异外，其他施压温度下的结果之间均有显著性差异，酪蛋白消化物的峰面积在实验所选择的施压温度下均有显著性差异;当模拟胃液消化时间为30m in时，酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面积在不同施压温度下有显著性变化;当模拟胃液消化时间为60m in时，酪蛋白的峰面积在各施压温度下均有显著性变化，虽然酪蛋白消化物的峰面积在施压温度为20℃和25℃下的显著性分析没有差异，但在其他施压温度下均有显著性变化。

图4 350MPa保压20min条件下不同温度处理牛初乳其酪蛋白可消化性的变化Fig.4 Digestibility change of casein at different temperature treatment bovine coloctrum with 350MPa for 20min

2.5 保压时间对牛初乳中酪蛋白模拟胃液可消化性的影响

当处理压强和施压温度固定为350MPa和30℃，分别选取10、20、30、40、50和60min的时间条件处理牛初乳，对处理后的样品进行模拟胃液的消化实验，再采用毛细管电泳仪对其进行检测。

图5中A、B分别为样品酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面积。由图5可知，当模拟胃液消化时间一定时，在所选的保压时间范围内，保压时间越长，酪蛋白的峰面积越小，酪蛋白消化物的峰面积越大，说明保压时间越长，酪蛋白模拟胃液的可消化性越好。当模拟胃液的消化时间为30min时，酪蛋白的峰面积保压时间为50min和60min时无显著性差异，其他保压时间条件下的处理结果均有显著性差异(p＜0.05)，酪蛋白消化物的峰面积在各个保压时间条件下的处理结果均有显著性差异(p＜0.05);当模拟胃液的消化时间为60min时，酪蛋白的峰面积在保压时间为40m in和50m in时无显著性差异，其他保压时间条件下的处理结果均有显著性差异(p＜0.05)，酪蛋白消化物的峰面积在各个保压时间条件下的处理结果均有显著性差异(p＜0.05)。

图5 350MPa施压温度30℃条件下不同时间处理牛初乳其酪蛋白可消化性的变化Fig.5 Digestibility change of casein at different time treatment bovine coloctrum with 350MPa and 30℃

2.6 高静压处理对牛初乳中酪蛋白模拟胃液可消化性影响的条件优化

表2 高静压处理牛初乳条件优化Table2 The conditions optimization of high static pressure processing bovine colostrum

由表2牛初乳中酪蛋白模拟胃液消化30m in后的相关数据，分析k值可知，最优组合为A3B3C3，即处理条件为550MPa、40℃、25m in;由极差分析结果可知:RA＞RB＞RC，因此上述三个影响因素对牛初乳中酪蛋白可消化性的作用大小顺序为:压强大小＞施压温度＞保压时间;依据模拟胃液消化60min后牛初乳中酪蛋白含量的相关数据，k值分析和极差分析的结果均与模拟胃液消化30min后的结果相一致。

在优化条件下处理牛初乳，即进行最优组合A3B3C3的验证实验，结果显示，酪蛋白模拟胃液消化30m in和60m in后的峰面积分别为31027mAu和0。由表2中数据可知，在 550MPa、35℃、15min和500MPa、40℃、15m in和550MPa、40℃、20m in这三个条件下，60m in后酪蛋白已全部被消化。但相比消化时间为30m in的效果，选择压力为550MPa、施压温度40℃、保压25m in处理牛初乳效果更好。

3 讨论

超高压处理改变了蛋白质三级、四级结构的非共价键，随着压力的增大，酪蛋白胶粒中的氢键、疏水作用力和离子键逐步被打断，蛋白胶粒被压缩，直径减小［22］，从而影响了蛋白质的结构和性质，使得高压处理后的蛋白质因结构伸展而松散，暴露出更多的酶切位点，进而易于酶解反应的进行，促进了酶对蛋白质的催化特性［23－24］，提高了蛋白质的可消化性，有利于人体对营养成分的吸收。

研究表明，β－乳球蛋白、卵清蛋白经超高压处理后，酶解能力得到了很好地改善［25－28］。Henrik Stapelfeldt等［29］研究发现，β－乳球蛋白会随着处理压力的升高，可消化性逐渐增强。Vander Plancken等［30］和Quirós等［25］报道，超高压处理会促进卵清蛋白被胰蛋白酶所水解。郑晓莹等［31］以12%TCASN/TN含量的变化为指标研究超高压处理对Feta奶酪成熟期限的影响，发现超高压处理可以加速蛋白质的降解。赵伟等［32］采用吸光度法检测牡蛎蛋白酶水解活力的实验中表明，超高压处理提高了蛋白质水解酶的活力，而且水解程度随着压力的升高而增大。卢婷等［33］在加热与超高压对缢蛏蛋白质变性及酶解的影响的研究中发现，超高压加工的缢蛏比热加工的产品被酶水解的程度增大，更易于被人体消化吸收。郑捷等［34］采用SDS－PAGE电泳检测海鲈鱼鱼肉时发现，超高压处理会使肌浆蛋白和肌原纤维蛋白发生变性，降解程度加剧。

4 结论

在所选择的实验条件范围内，牛初乳经过超高压处理以后，酪蛋白模拟胃液的可消化性得到了很好的改善作用，与上述研究超高压处理会使得一些蛋白被酶水解的程度或者降解能力增强相一致。那是因为超高压处理改变了酪蛋白的分子结构，使得酪蛋白在模拟胃液的消化反应中促进了酶对其的催化反应进程，从而改善了酪蛋白在模拟胃液中的可消化性，而且处理压强、施压温度和保压时间均会影响酪蛋白的可消化性效果。

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