孙中贯，刘咏，姚建铭

(1.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；3.中国科学院合肥物质科学研究院等离子体物理研究所，安徽 合肥 230031)

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，简称DHA），有脑黄金之称，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。而动物和人体不能自身合成二十二碳六烯酸，必须从外界摄入[1]。二十二碳六烯酸具有健脑、提高记忆力和视力的作用，尤其它可以促进胎儿脑细胞发育和婴幼儿脑细胞生长，防治老年性痴呆及动脉粥样硬化、脑血栓等心脑血管疾病，受到食品界和医疗界的广泛关注[2]。二十二碳六烯酸传统的来源是从鱼油中获取，但由于受到原料、生产周期等诸多限制因素的影响，很难满足生产消费的需求。利用隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸具有发酵周期短、培养方式简单、产品质量稳定等优点，且隐甲藻发酵产生的油脂中几乎不含影响婴幼儿生长发育的二十碳五烯酸(EPA)，已被批准添加到婴幼儿的食品和营养品中[3-4]。但因藻种二十二碳六烯酸产量较低，满足不了工业化生产的要求，使其应用受到限制。二十二碳六烯酸的生物合成是一个复杂的过程, 为了提高其产量可以从多方面入手, 寻找适合藻株生长代谢的营养源以及发酵方式是一条可行的途径。

已报道的有关隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸培养基的研究，都是对单一营养源[5-9]或多种营养源进行考察和评价[10]，尚未有应用响应面法对培养基中各营养组分进行综合考察和研究的报道。笔者在前期工作中诱变得到一株遗传性状稳定的隐甲藻藻株LS1057，本实验在前人研究的基础上结合预实验，从优化营养源入手，利用SAS9.2统计软件综合考察和评价了隐甲藻LS1057发酵生产二十二碳六烯酸发酵培养基中的各组分，对主要影响因素进行优化；并对优化结果进行了中试发酵试验验证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

隐甲藻(Crypthecodinium cohnii) LS1057，由本实验室采用亚硝基胍诱变得到[11]；菌种活化培养基 葡萄糖5.0g/L，酵母膏1.0g/L，海盐 20.0g/L，蒸馏水配制；种子培养基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海盐16.0g/L，蒸馏水配制；发酵培养基 葡萄糖30.0g/L，酵母膏6.0g/L，海盐16.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L，KH2PO40.1g/L，KNO35.0g/L，FeSO4·7H2O 0.2g/L，M液1%(V/V)，采用蒸馏水定容，调整pH为7.0；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L；扩大培养基 葡萄糖8.0g/L，酵母膏2.5g/L，海盐 20.0g/L，蒸馏水配制；种子罐培养基 葡萄糖10.0g/L，酵母膏3.0g/L，海盐20.0g/L，MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液1%(V/V)，采用自来水定容，调整pH为6.5；M液 VB10.6g/L，VB120.1mg/L。发酵罐培养基 采用优化后的培养基，葡萄糖浓度改为优化后浓度的一半，其余培养基成分不变。二十二碳六烯酸标准品 美国SIGMA公司，纯度≥99%；泡敌(甘油聚氧丙烯醚) 非离子型，江苏省海安石油化工厂；维生素 B1、维生素 B12 生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；海盐 德国AB速溶生态盐；其他试剂 均为分析纯。DL-5-B型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；DZF-6030B真空干燥箱 东莞市豪邦工业设备有限公司；XFH-75CA型电热式压力蒸汽灭菌器 深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；GC-14C气相色谱仪（配有氢火焰离子化检测器(FID)和N2000色谱工作站）日本岛津公司；GUJS-70L型机械搅拌不锈钢发酵罐 镇江东方生物工程设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养方法 菌种活化：种子液为低温黑暗条件下甘油管保存的种液，250m L三角瓶，装液量20%(V/V)，接种量2%(V/V)，25℃、100r/min振荡培养72h。液体种子培养：种子液为菌种活化培养液，250mL三角瓶，装液量20%(V/V)，接种量2%(V/V)，25℃、100r/min振荡培养 72h；摇瓶发酵培养：种子液为摇瓶液体种子培养液，500m L三角瓶，装液量10%(V/V)、接种量10%(V/V)，26℃、150r/m条件下振荡培养 216h。摇瓶扩大培养：种子液为菌种活化培养液，1000m L三角瓶，装液量30%(V/V)，接种量10%(V/V)，28℃、150r/min振荡培养72h。

1.2.2 生物量的测定 50m L样液装入预先称重的离心管中，4000r/min离心5min，沉淀用蒸馏水洗涤3次，50℃真空干燥，在干燥器内冷却后称重，直至恒重。

式中：W-细胞干燥后的重量/g；V-所量取的发酵液体积/m L。

1.2.3 油脂含量的测定 采用 Soxhlet法[12]提取菌体中的总油脂。称取一定量的干菌体加入适量的石英砂于研钵中进行研磨，研磨至菌体成粉末状用滤纸包好后，50℃真空干燥至恒重，称重后进行提取。提取试剂：正己烷，虹吸速率：8～12次/h。水浴温度：85℃，提取时间12h。分别称量提取前后纸包的重量。

式中：W1-提取前纸包重/g；W2-提取后纸包重/g；W0-干菌体重/g。

1.2.4 二十二碳六烯酸含量的测定

1.2.4.1 油脂的甲酯化 取50mg油脂，置于100mL的磨口烧瓶中，加入0.5mol/L氢氧化钾的甲醇溶液2m L，于60℃水浴30min进行皂化，冷却后加入2m L三氟化硼-乙醚（体积比为1:1）溶液，60℃水浴10min，冷却后加入5m L正己烷振荡，然后加入5m L饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相，抽取上层可直接进样。

1.2.4.2 脂肪酸检测 气相色谱法，色谱条件为：FID 检测器，毛细管色谱柱DB-23(30m×0.32mm)，载气为纯度为99.99%的氮气，分流比 1:70。进样口温度200℃，检测器温度250℃，进样量1μL。采用程序升温，140℃保持3min，10℃/min升温，升温至250℃，保持15min，每个样29min，为保持数据的准确性，每个样品进样两次，取平均值。在同一色谱条件下，用已知的二十二碳六烯酸标准品色谱峰的保留时间与样品脂肪酸甲酯组分色谱峰的保留时间对照进行分析。

1.2.5 发酵液中还原糖的检测 采用DNS法[13]对发酵液中的还原糖含量进行测定。

1.3 响应面法(Response Surface Analysis, RSA)的实验设计

1.3.1 Plackett-Burman设计试验 从发酵培养基各种成分中筛选出对二十二碳六烯酸产量影响比较显著的因素。利用SAS统计软件对试验结果进行各个因素的显著性分析；采用多元线性回归模型中的逐步回归法[14]拟合显著因素与产量之间的线性方程。拟合的方程为：Y=β0+β1X1+β2X2+…+βnXn，式中Y为二十二碳六烯酸的产量(g/L)，X1、X2…Xn为显著因素，β0为截距，β1、β2…βn为线性系数，n为显著因素的个数[15]。对发酵培养基的8种成分进行考察，每个因素选高(+1)和低(-1)2个水平，根据预实验的结果和Plackett-Burman试验设计的要求，Plackett-Burman试验的因素和水平见表1。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素水平范围Table1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡实验设计 对Plackett-Burman实验的因素作显著性分析，找出显著因素。根据拟合函数回归系数的符号和大小来设计显著因素的最陡上升路径，其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值[16]。试验组数由经验来定，步长由显著因素的效应值确定。通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，从而逼近最大响应区域。

1.3.3 Box-Behnken法设计实验 三因素三水平的中心组合实验共需15次实验。拟合出的一个二次多项式方程是描述响应变量与自变量的经验模型，对于三因素系统，模型可表述为：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X+β12X1X2+β13X1X3+β22X+β23X2X3+β33X，式中X1、X2、X3为对响应值影响显著的3种培养基组分的质量浓度，Y为预测响应值，即二十二碳六烯酸的产量(g/L)，β0为常数项，β1、β2、β3为线性系数，β11、β22、β33为平方系数，β12、β13、β23为交互作用系数[17]。综合最陡爬波试验的结果，根据 Box-Behnken的中心组合实验设计原理，响应面实验因素水平见表2。用SAS(Version 9.2)对实验数据进行回归性分析，用t检验验证回归系数的显著性，用F检验评价模型方程的显著性，方程的拟合性由确定系数R2确定。

表2 响应面分析试验因素水平表Table2 Factors and level value of response surface analysis

1.4 模型验证 用SAS(Version 9.2)对多元函数进行拟合和方差分析。对Y进行岭嵴分析，可确定出其极值点[18]。再按照计算所得到的参数进行验证实验，以检验模型的重复性和可靠性，确定最后的优化结果。

1.5 中试发酵试验验证

1.5.1 发酵试验方法

1.5.1.1 种子罐培养 种子液为摇瓶扩大培养液，发酵罐体积30L，培养体积15L。121℃灭菌25min，灭菌前加入5m L泡敌。接种量10%(V/V)，罐温28℃，罐压0.05MPa，搅拌转速100r/min，通气量30L/min，pH6.5用质量分数为20%柠檬酸进行调节，培养时间72h。

1.5.1.2 发酵条件 发酵罐体积 70L，装液量 40L。121℃灭菌 25min，灭菌前加入 10mL泡敌。接种量5L，培养体积45L，罐温30℃，96h后调至25℃，罐压0.1MPa，搅拌转速150～300r/min，通气量50～90L/min，pH6.5用质量分数为20%柠檬酸进行调节。搅拌转速与通气量根据溶氧量进行调节，从接种后开始，每隔 12h取样，直至发酵结束。培养时间为216h。

1.5.2 分批补料发酵策略 在摇瓶发酵实验的基础上，进行分批补料发酵试验。根据发酵液中剩余葡萄糖的浓度，确定葡萄糖的补加时间。发酵开始时，发酵培养基中葡萄糖的质量分数为3.5%，在发酵过程中当发酵液中的葡萄糖质量分数接近0.5%时，以补料的最大速度进行葡萄糖的添加，添加量为发酵液体积的2%(V/V)。以此种方式进行葡萄糖的添加，葡萄糖的最终使用量不超过80g/L(以发酵体积计)。补加的葡萄糖质量分数为50%。

2 结果与讨论

2.1 影响二十二碳六烯酸摇瓶发酵的显著因素的筛选

选用n=12的设计方案，对发酵培养基的8种成分进行考察，Plackett-Burman试验设计与结果见表3。运用SAS9.2软件对各因素效应进行t检验，选择影响二十二碳六烯酸摇瓶发酵的显著性因素，各因素的效应分析结果见表4。从表4中可以看出，培养基成分及接种量对二十二碳六烯酸产量的影响显著性的排序为：葡萄糖>酵母膏>KH2PO4>KNO3>MgSO4·7H2O>海盐>M液>FeSO4·7H2O。其中，对二十二碳六烯酸产量有显著(p<0.05)影响的因素为X1（葡萄糖）、X2（酵母膏）、X5(KH2PO4)，利用多元线性回归模 型 中 的 逐 步 回 归 法 拟 合 (p<0.05)得 到 的 线 性 方 程 为：Y=1.200667+0.092833X1+0.057333X2+0.048333X5，方程的决定系数 R2=0.9649，表明该回归方程拟合良好。从方程可以看出三个显著因素均具有正效应，故应适当增加这三者的质量浓度，做进一步的考察。X3（海盐）、X4(MgSO4·7H2O)、X6(KNO3)、X7(FeSO4·7H2O)、X8（M液）对二十二碳六烯酸产量的影响并不显著，根据Plackett-Burman试验确定的效应值符号，各非显著因素的取值分别为：海盐20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L、M液1%(V/V)。

表3 Plackett-Burman试验设计及响应值表Table3 Plackett-Burman test design and results (cellulaes activity)

3-1 1 1-1 1-1-1-1 1.229 4 1-1 1 1-1 1-1-1 1.243 5 1 1-1 1 1-1 1-1 1.372 6 1 1 1-1 1 1-1 1 1.489 7-1 1 1 1-1 1 1-1 1.126 8-1-1 1 1 1-1 1 1 1.041 9-1-1-1 1 1 1-1 1 1.080 10 1-1-1-1 1 1 1-1 1.283 11-1 1-1-1-1 1 1 1 1.146 12-1-1-1-1-1-1-1-1 1.025

表4 Plackett-Burman试验因素水平及其效应评价Table4 Levels and effects of eight factors after Plackett-Burman design optim ization

2.2 最陡爬坡实验研究最大响应值的响应区域

响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分近似真实情况，因此应先使得显著因素的水平尽量逼近二十二碳六烯酸的最大产量区域再建立有效的拟合方程，最陡爬坡试验可以满足这一要求。根据Plackett-Burman试验设计法筛选出的显著因子的效应大小设计它们的步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找二十二碳六烯酸的最大产量区。试验设计及结果如表5所示。二十二碳六烯酸的最大产量区在第4次实验附近，以实验4的条件为响应面实验因素水平的中心点，进行响应面实验设计。

表5 最陡爬坡试验设计与结果Table5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

产量(g/L) 1 40 8 0.2 1.208 2 50 10 0.3 1.437 3 60 12 0.4 1.585 4 70 14 0.5 1.682 5 80 16 0.6 1.467 6 90 18 0.8 1.329

2.3 Box-Behnken法确定显著因素的最优水平

采用Box-Behnken响应面试验设计确定显著因素的最优水平，试验设计与结果见表6。15个试验点分为两类：一类是析因点，共12个；一类是零点(试验点13，14，15)为区域的中心点。零点重复3次，用于估计试验的误差。

表6 Box-Behnken 响应面设计及试验结果Table6 Response surface Box-Behnken design and corresponding response

根据表6的实验结果，以二十二碳六烯酸产量Y值为效应值，由SAS9.2软件拟合得到的回归方程模型为：Y=1.779667+0.217875X1+0.036625X2-0.02625X5-0.222958X-0.08475X1X2+0.034X1X5-0.148458X-0.0915X2X5-0.133708X。回归模型方差分析见表7，系数估计见表8。

表7 回归模型的方差分析Table7 Analysis of variance (ANOVA )of quadratic polynom ial model

模型 9 0.753316 0.083702 139.53 <0.0001误差项 5 0.002999 0.0006拟合项 3 0.002927 0.000976 26.85092 0.0361纯误差项 2 0.000073 0.000036合计 14 0.756315

表8 回归方程系数显著性检验表Table8 Significance test of regression coefficient

方程自变量平方项的符号皆为负值，即抛物线的开口向下，因此存在对应的极大值点。由方差分析可知，大于F值的概率为小于0.0001，表明回归方程模型的显著性及可靠性极好，不同处理间的差异非常显著；而且模型的调整决定系数R2Adj=0.9889，表明了相应模型可以解释 98.89%的总体变异情况，只有 1.11%的变异无法用模型来解释，回归模型有高度的相关性[19-20]。可以用这个模型对二十二碳六烯酸的产量进行分析和预测。联合响应面回归分析和回归方程绘制的响应面图形如下（图1～图4）：

图1 葡萄糖与酵母膏交互影响二十二碳六烯酸产量的预测响应面图Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of glucose and yeast extract on the yield of DHA

图2 葡萄糖与KH2PO4交互影响二十二碳六烯酸产量的预测响应面图Fig.2 Response surface plot for the interaction effects of glucose and KH 2PO4 on the yield of DHA

图3 酵母膏与KH2PO4交互影响二十二碳六烯酸产量的预测响应面图Fig.3 Response surface plot for the interaction effects of yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA

图4 葡萄糖、酵母膏和KH2PO4影响二十二碳六烯酸产量的预测剖面图Fig.4 Prediction profiler of glucose, yeast extract and KH 2PO4 on the yield of DHA, respectively

通过观察上述图系，可以得出：回归方程存在稳定点，即最大值点。对 Y进行岭嵴分析，得到极大值所对应的各显著因素X1、X2、X5的编码值分别为 0.488、0.000、0.000，即葡萄糖浓度为79.76g/L，酵母膏浓度为14g/L，KH2PO4浓度为0.5g/L，在此点预测的二十二碳六烯酸的产量为1.833g/L。X1、X2，X1、X5和 X2、X5的等高线都是椭圆，表明元素间的交互作用显著[20]。

2.4 验证实验

为检验模型预测的准确性，在优化条件下进行5组发酵实验，所测的二十二碳六烯酸的产量分别为1.810、1.815、1.807、1.814、1.809g/L，平均产量为1.811g/L，与模型预测值非常接近，表明设计模型能很好地预测实际的发酵情况。

2.5 中试发酵试验

在优化后的摇瓶发酵培养基条件下，对突变株LS1057进行了70L发酵罐的分批补料发酵试验。共进行了3次中试发酵试验，三次发酵的平均发酵水平为：菌株生物量达到28.13g/L，总油脂含量为23.49%，二十二碳六烯酸终产量为2.112g/L，比摇瓶发酵的1.811g/L提高了16.62%。试验结果表明经响应面法优化得到的发酵培养基能有效的提高隐甲藻LS1057生产二十二碳六烯酸的产量。

3 结论

运用Plackett-Burman试验设计，对影响藻株LS1057代谢产生二十二碳六烯酸的发酵培养基组分进行了评价和分析，筛选出葡萄糖、酵母膏、K2HPO4为主要影响因素。然后通过最陡爬坡实验逐步改变三者的浓度，逼近最佳响应面区域；最后根据 Box-Behnken中心组合设计原理，并结合响应面的分析结果，确定了优化的培养基组成为：葡萄糖79.76g/L，酵母膏14.0g/L、KH2PO40.5g/L、海盐20.0g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KNO38.0g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L和M液(M液：VB10.6g/L，VB120.1mg/L)1%(V/V)。二十二碳六烯酸的发酵产量由原来的1.057g/L[11]提高到2.112g/L，增长了 99.81%。同时，回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明回归方程能较真实地反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况是比较吻合的，因此采用响应面法优化发酵培养基组成是提高二十二碳六烯酸产量的有效途径之一。

[1] Ward O P, Singh A.Omega-3/6 fatty acids: alternative sources of production[J].Process Biochemistry, 2005, 40(12): 3627-3652.

[2] Sijtsma L, De Swaaf M E.Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid[J].M icrobiol Biotechnol, 2004, 64(2): 146-153.

[3] Mendes A, Reis A, Vasconcelos R, et al.Crypthecodinium cohnii w ith emphasis on DHA production: a review[J].Journal of Applied Phycology, 2009, 21(2): 199-214.

[4] Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production[J].Biochimie, 2004, 86(11): 807-815.

[5] 王永华, 梁世中, 杨博.碳、氮源对隐甲藻油脂和DHA 积累的影响[J].中国油脂, 2001, 26(6): 58-60.

[6] Wang Jufang, Wu Haizhen, Liang Shizhong, et al.Effect of nitrogen sources on the grow th anddocosahexaenoic dcid accumulation in Crypthecodinium cohnii[J].Marine Science Bulletin, 2002, 4(1): 87-92.

[7] 王永华, 梁世中, 杨博, 等.隐甲藻发酵产 DHA 最佳无机盐浓度的确定[J].中国油脂, 2002, 27(2): 26-28.

[8] Behrens P W, Thompson J M, Apt K, et al.Production of high levels of DHA in microalgae using modified amounts of chloride and potassium[J].WO Patent, PCT/US2004/032383, 2005.

[9] 荣辉, 黄惠琴, 鲍时翔.几种不同碳、氮源对隐甲藻生长及二十二碳六烯酸产量的影响[J].生物技术通报, 2007, 18(6): 968-970.

[10] 王菊芳, 梁世中, 吴振强, 等.碳氮比对隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)总脂及DHA含量的影响[J].华南理工大学学报: 自然科学版, 2000, 28(10): 28-31.

[11] 孙中贯, 刘咏, 姚建铭, 等.高产二十二碳六烯酸隐甲藻的选育及其发酵条件研究[J].食品科学, 2013, 34(5):202-206.

[12] 吴国锋, 李国全, 马永强.工业发酵分析[J].北京: 化学工业出版社, 2006: 22-23.

[13] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].北京: 科学出版社, 2002: 97-100.

[14] 阮敬.SAS统计分析从入门到精通[M].北京: 人民邮电出版社, 2009: 168-172.

[15] 凌宏志, 葛菁萍, 平文祥, 等.响应面法优化黑曲霉HDF05产β-葡萄糖苷酶过程参数[J].生物工程学报, 2011, 27(3)： 419-426.

[16] 王普, 孙立明, 何军邀.响应面法优化热带假丝酵母104 菌株产羰基还原酶发酵培养基[J].生物工程学报，2009, 25(6): 863-868.

[17] Guo Ying, Xu Jingliang, Zhang, et al.Medium optimization for ethanol production w ith Clostridium autoethanogenum w ith carbon monoxide as sole carbon source[J].Bioresource Technology, 2010, 101: 8784-8789.

[18] 冯培勇, 钟旭生, 杨立红, 等.利用响应面法优化茶薪菇产纤维素酶的发酵条件[J].食品科学, 2009, 30(7): 162-165.

[19] Wang Zhiwen, Liu Xunli.Medium optimization for antifungal active substances production from a new ly isolated Paenibacillus sp.using response surface methodology[J].Bioresource Technology, 2008, 99: 8245-8251.

[20] 毋锐琴, 杜双奎, 李志西, 等.细菌纤维素发酵培养基的优化及超微观结构分析[J].生物工程学报, 2008, 24(6): 1068-1074.