吴旭丽，童群义

（江南大学食品学院，江苏无锡，214122）

杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）又称茶菊，是一种药食同源的植物，主要产自浙江省桐乡、海宁、吴兴、嘉兴等地[1]。现代医学已证明杭白菊具有抑菌、抗炎、抗氧化、降血脂、抗心血管疾病的功效[2]。采用现代工艺提取的菊花汁可直接饮用，或经进一步深加工成浓缩粉、浓缩汁等食品配料，从而提升产品附加值。

制备食用型菊花汁（区别于药用），应尽量避免或减少使用有机试剂，减少试剂残留的危险的同时也可减少溶剂成本。黄酮类物质、绿原酸、挥发油是杭白菊发挥以上功效的主要活性物质[2]。菊花中的黄酮类物质大都以苷类形式存在，苷类物质易溶于水、乙醇等极性溶剂；绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸组成的缩酚酸，在热水中溶解度较大；菊花中的挥发油包含饱和烷烃、醇、烯、醛、酮、酯等物质，研究证明，水提菊花汁中至少含有36种挥发油，占体系总挥发油种类的99%[3]。因此，以水为溶剂提高食用菊花提取率更有研究意义。

超声和微波技术应用广泛,超声波可破坏细胞壁，增加溶剂穿透性，从而增加物质提取率并缩短提取时间[4]；微波萃取是通过微波迅速、均匀加热以提高提取效率，不同物质对微波能的吸收不同，可以实现选择性萃取[5]。微波处理可增加黄酮等植物次生代谢产物及芳香物质的回收率[6]。基于以上特点，超声、微波协同辅助提取在实现较高得率的同时减少溶剂用量，从而减少溶剂成本及后续深加工（如浓缩、干燥等）的能耗和时间。目前传统的水提法[7]，如常温浸提、加热回流以及新型超声或微波单独辅助提取的研究成果较多，但少有超声、微波协同水提食用菊花汁及与传统提取方法的系统比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杭白菊朵菊 购自浙江嘉兴市；芦丁标准品（纯度≥99.9%，UV分析纯），绿原酸标准品（纯度≥99.9%，HPLC分析纯） 均购自上海源叶生物科技有限公司；双圈牌9cm慢速定量滤纸 购自杭州沃华滤纸有限公司；0.22μm水相微孔滤膜 购自上海新亚净化材料厂；亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，95%乙醇，磷酸，磷酸二氢钠，三氯甲烷，乙酸乙酯 均为分析纯；超纯水，甲醇 均为色谱纯。

FW-80-1高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；CW-2000型超声-微波协同萃取仪 超声波固定频率40kHz，功率50W，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；UV-2100型紫外分光光度仪 上海龙尼柯仪器有限公司；自动进样高效液相色谱仪日立；Ultimate AQ-C18色谱柱 美国Welch Material, InC.；鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；AB104-N电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FA1004电子天平 上海天平仪器厂；SHZ-D（Ш）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理与萃取 干燥杭白菊花序用万能粉碎机粉碎，过60目筛，粉末备用。用分析天平准确称取2.50g菊花粉末于微波-超声专用500m L萃取烧瓶中，按1.2.5.1所对应料液比加入蒸馏水，浸润后，分别按1.2.5.2和1.2.5.3所述萃取时间、微波功率条件在超声微波萃取仪中萃取。萃取完毕，静置10min，用双层定量滤纸抽滤2次。滤液用蒸馏水定容至250m L，用于检测。

1.2.2 总黄酮含量测定

1.2.2.1 绘制芦丁标准曲线 准确称取芦丁标准品17.16mg，用95%乙醇溶解，超声10min使其完全溶解，并用95%乙醇定容至50m L，配制成0.3432mg/m L的芦丁标准溶液。分别取芦丁标准溶液1、2、3、4、5、6m L于25m L容量瓶中，并用蒸馏水加至总体积为10mL；加入1mL1.0%NaNO2，摇匀，静置6min；加入1m L10%Al（NO3)3，摇匀，静置6min；加入10m L4.0%NaOH，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10min；于510nm下检测吸光值[8]。以总黄酮浓度为x横坐标，吸光值为y纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品总黄酮含量的测定 取各供试液1m L于25m L容量瓶，根据1.2.2.1中测定标准曲线的方法，测定510nm下样品UV吸光值。吸光值代入标准曲线方程中，并换算出总黄酮提取率（mg/g)。

总黄酮提取率（mg/g)= X1/W ×250

式中，X1为由总黄酮标准曲线得到的总黄酮含量，mg；W为菊花粉末质量，g；250为测定液与样液总量的换算指数。

1.2.3 绿原酸含量测定

1.2.3.1 绿原酸含量测定色谱条件。

色谱柱为AQ-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流动相A为1.0%磷酸二氢钠水溶液（以2m L/L比例添加磷酸调节pH至2.7）；流动相B为甲醇（色谱纯）；70%流动相A与30%流动相B等度洗脱30min；流速为1.0m L/min；柱温30℃；检测器为DAD紫外检测器；检测波长为328nm[9]

1.2.3.2 绿原酸标准曲线 准确称取19.70mg绿原酸标品，用超纯水配制成0.1970mg/m L的绿原酸标准液。进样量为1、2、3、4、5μL，在1.2.3.1色谱条件下测定不同进样量对应的绿原酸峰面积。以绿原酸含量为x横坐标，以峰面积（103)为y纵坐标，绘制绿原酸标准曲线。

1.2.3.3 样品绿原酸含量测定 准确移取1.2.1中供试液10m L于洁净已称重的6cm直径玻璃皿中，于40℃烘箱放置12h至烘干；加5m L氯仿，浸泡5min，弃氯仿液；加5m L乙酸乙酯，浸泡5min，弃乙酸乙酯，入40℃烘箱1h挥干有机溶剂，称重（记为M）；加5mL超纯水，待样品完全溶解后，经0.22μm的水相微孔滤膜过滤[10]。按 1.2.3.1的色谱条件测样品在绿原酸保留时间对应的峰面积，进样量为10μL。根据绿原酸标准曲线，换算出绿原酸的提取量（mg/g）。

式中，X2为由标准曲线得到绿原酸含量（mg）；W为菊花粉末质量，g；12.5为测定液与样液总量的换算指数。

1.2.4 固形物提取率测定 固形物提取率反映杭白菊的原料利用率，关系到成本问题。通过称量法[11]，可测定固形物提取率。

式中，M0——1.2.3.3中玻璃皿质量，g；M为1.2.3.3中挥干有机溶剂后皿和样品总质量，g；W为菊花粉末质量，g；25为测定液与样液总量的换算指数。

1.2.5 单因素实验 以菊花提取液中总黄酮提取率（mg/g）、绿原酸提取率（mg/g)以及固形物提取率（%)为指标，做料液比（g∶m L)、时间（min)、微波功率（w)的单因素实验，研究各个因素对菊花提取液质量和产量的影响规律。

1.2.5.1 料液比对提取效果的影响 准确称取菊花粉末 2.50g，设定微波功率300W，提取时间300s，分别加蒸馏水至料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70（g:m L），测定绿原酸、总黄酮、固形物的提取率。

1.2.5.2 微波功率对提取效果的影响 准确称取菊花粉末2.50g，加蒸馏水至料液比为1:40，设定提取时间300s，微波功率分别为0、100、200、300W，测定绿原酸、总黄酮、固形物的提取率。

1.2.5.3 提取时间对提取效果的影响 准确称取菊花粉末2.50g，加蒸馏水至料液比为1:40，设定微波功率300W，分别设定提取时间为120、210、300、390、480s，测定绿原酸、总黄酮、固形物的提取率。

1.2.6 正交优化实验 在单因素研究结果的基础上，以菊花提取液中总黄酮提取率（mg/g）、绿原酸提取率（mg/g)以及固形物提取率（%)为指标，料液比（g:m L)、时间（s)、微波功率（W)为主要因素，选取L9（34），按表1进行3水平3因素正交实验。每个试验重复三次。实验数据用SPSS软件分析。

表1 正交因素水平设计表Table1 Design of orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 标准曲线拟合分析

2.1.1 总黄酮标准曲线 总黄酮标准曲线的线性回归方程如下： y=0.3566x+0.0514， R²=0.9955。

式中，x为总黄酮浓度，mg/m L；y为样品吸光值。R²＞0.99，方程拟合得到的总黄酮含量结果可靠。

2.1.2 绿原酸标准曲线 绿原酸标准曲线的线性回归方程如下：y=12659.8x+81.619，R²= 0.9995。

式中，x为绿原酸含量，μg；y为峰面积，103。R²＞0.99，方程拟合得到的绿原酸含量结果可靠。

2.2 单因素实验分析

2.2.1 料液比对提取率的影响 如图1和图2，在1:20～1:50的料液比范围内，总黄酮、绿原酸和固形物的提取率均随料液比的增加而增大，并在1:50时达到最大值60.36mg/g、3.81mg/g、47.96%。料液比1:50时各物质的提取率已趋于饱和，溶剂量进一步增大则影响物质的提取。这是因为微波加热作用下原料的毛细孔特性增强，使提取溶剂的渗透作用更有效[12]，并且同超声波一起作用于细胞，加速其瓦解，从而加快传质速率[13]；物质传递是物质从物料粉末内部（固相）向溶剂（液相）扩散的过程[14]。当溶剂量大，则两相间的物质浓度差大，扩散推动力也大，从而更有利于物质的溶出；而在1:50以后，溶剂量增大使能量分散，而超声微波发生器位于提取瓶下方，液面越高微波超声功率越弱[13]，整体提取效率比能量集中时弱，因而随着溶剂量增大提取率略有下降。

总体观察料液比对总黄酮、绿原酸和固形物的提取率影响不明显。考虑到后续浓缩加工、运输的成本，尽量选取提取率较高而低料液比的条件。因此，可对1:30～1:50范围内的提取效果做进一步研究。

图1 料液比对总黄酮提取率和绿原酸提取率的影响Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

图2 料液比对固形物提取率的影响Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on extraction yield of solid content

2.2.2 超声-微波时间对提取率影响 如图3，随提取时间增加，总黄酮和绿原酸的提取率明显增加，并在210s处分别达到高峰60.33mg/g和3.85mg/g，而后又显著下降，并保持在略高于120s时的水平。如图4，固形物提取率也呈现相似的趋势，但在210s与300s达到几乎相同的水平。其原理是，在微波作用下溶剂温度会迅速升高，温度升高可加快分子的运动，从而增加物质的溶出[10]，但超声作用会使溶剂中的气泡破裂，造成局部高温和高压，进而诱发酚类物质结构的瓦解[13]，因此长时间的微波超声作用会使黄酮、绿原酸等敏感性物质变性的可能性增加，导致紫外下的特征吸收减弱。

300s时固形物提取率虽然较高，但菊花中的重要质量指示性物质绿原酸和总黄酮有一定的损失。综合考虑耗能等因素，可对邻近210s的提取时间做最优化实验。

图3 提取时间对总黄酮提取率和绿原酸提取率的影响Fig.3 Influence of extracting time on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

图4 提取时间对固形物提取率的影响Fig.4 Influence of extracting time on extraction yield of solid content

2.2.3 微波功率对提取率的影响 如图5、6，微波功率0～200W范围内，随功率的增加，总黄酮、绿原酸、固形物提取率的增加十分显著，200W时分别达到最大值60.07mg/g、3.97mg/g、48.05%；而随后各指标都下降，其中绿原酸含量下降明显。微波和超声波能破坏生物细胞，使细胞内物质有效释放到提取介质中。细胞的瓦解又大大增加了接触面积，从而增加了物质从细胞内到溶剂的传质速率[12]；在一定范围内，微波功率越大，细胞破碎得越彻底，传质速率的增加越明显。然而，微波能量能穿透有机物质的碳链结构而到达官能团[13]，微波功率过大，可能引起敏感性物质的变性。绿原酸、总黄酮、固形物含量的下降说明在此提取条件下，大于200W时微波和超声的破坏作用可能比提取作用更明显。

因此，对邻近200W的微波功率可做进一步实验研究。

图5 微波功率对总黄酮提取率和绿原酸提取率的影响Fig.5 Influence of microwave power on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

图6 微波功率对固形物提取率的影响Fig.6 Influence of microwave power on extraction yield of solid content

2.3 正交实验结果与讨论

以总黄酮、绿原酸、固形物提取率为菊花提取液的评价指标，3因素3水平正交实验结果及分析见表2。极差分析结果表明，各因素对三个指标影响大小顺序相同，均为 A＞B＞C，即微波功率是影响各物质提取率最重要的因素，提取时间次之，料液比影响最小。这与单因素所得趋势吻合。

方差分析结果（表3）表明，对于绿原酸和总黄酮的提取率，仅微波功率（A）的不同水平会产生显著差异；对于固形物含量，微波功率（A）和提取时间（B）的不同水平均会产生显著差异。使总黄酮、绿原酸、固形物提取率最大化的提取条件分别为A3B2C2、A3B3C2、A3B3C1。

总黄酮和绿原酸是菊花提取液中最重要的功能性物质，也是工业上评价菊花产品质量的主要理化指标；在总黄酮和绿原酸提取率对应的最佳水平下，固形物提取率较可观；由于料液比的影响不显著，又从节水、节省空间、方便运输和后续加工的角度考虑，同等提取效果下选择低料液比条件为佳。因此，经综合评价，将最佳组合确定为A3B3C1，即250W、240s、1:30。

对正交实验确定的最佳条件进行验证，试验重复三次。结果表明，250W、240s、1:30的条件下，总黄酮提取率为62.20±0.30mg/g，绿原酸提取率为4.05± 0.06mg/g，固形物提取率50.75±0.3%。结果较理想，证明正交实验结果可靠。

表2 正交实验结果与分析Table2 Result and analysis of orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示差异显著，p＜0.05.

2.4 提取方法比较

为了证明超声-微波协同提取法的优越性。在相同实验室环境下，用几种常规提取方法制备杭白菊水提液，并与本论文所研究的方法进行比较。所用料液比均为1:30（g:m L）。提取条件及结果如表4所示。

由表4可知，超声微波协同辅助法的提取效率明显高于传统提取法和单独的超声/微波辅助法。其中，热回流法的提取效率较高，略低于超声微波法，但后者的提取时间是前者的1/30。短时间的单独超声辅助的提取效率略高于常温浸提，但不如热回流和含微波过程的提取方法。相比于效率较高、应用较广泛的传统热回流，超声微波法的总黄酮提取率提高了5.98%，绿原酸提取率提高4.09%，总固形物含量提高13.74%，并大大缩短了提取时间。

3 结论

通过单因素和正交实验确定微波功率250W，提取时间240s、料液比1:30（g:m L）的条件下，杭白菊的提取效率最高：总黄酮提取率达（62.20±0.30）mg/g，绿原酸提取率达（4.05±0.06）mg/g，固形物提取率50.75%±0.3%。

与浸提法、热回流法、微波辅助法比较，利用超声-微波协同制备杭白菊水提液，可以在较低的料液比下获得较高的提取率，同时缩短提取时间，减少有效物质的损失。本实验方法制得的菊花水提液总黄酮和绿原酸含量高，可作为菊花浓缩汁、菊花浓缩粉的原材料。虽然目前微波-超声协同萃取实现工业化还存在一定的困难，但本实验所得到的参数可为工业化研究提供一定的参考。

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