王 芳薛 杨杨静玉王 欢吴春福

（1沈阳药科大学神经药理系，沈阳，110016；2辽宁省植物多酚研究与开发工程技术研究中心，沈阳，110016）

实验研究

苹果多酚对卡介苗联合脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

王 芳1，2薛 杨1，2杨静玉1，2王 欢1，2吴春福1，2

（1沈阳药科大学神经药理系，沈阳，110016；2辽宁省植物多酚研究与开发工程技术研究中心，沈阳，110016）

目的：观察苹果多酚（Apple Polyphenols，AP）对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法：采用卡介苗联合脂多糖制备小鼠免疫性肝损伤模型。研究AP对小鼠肝指数和脾指数，血清中谷草转氨酶（Aspartate Transaminase，AST）和谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）活性，血清总蛋白（Total Protein，TP），白蛋白（Albumin，Alb）和白蛋白/球蛋白（A/G）含量的改善作用，同时采用HE染色方法观察AP对免疫性肝损伤小鼠肝脏病理改变的保护作用。结果：AP能明显抑制免疫性肝损伤模型小鼠异常升高的肝指数和脾指数，降低血清中AST活性，不同程度地升高血清中TP和Alb的含量，同时对肝组织病理异常变化也有显著的改善作用。结论：AP对卡介苗联合脂多糖所致的小鼠免疫性肝损伤具有保护作用。

苹果多酚；卡介苗；脂多糖；免疫性肝损伤

肝脏是机体排解毒物和代谢的重要器官，易受多种病原体、毒物及免疫紊乱所累及，引发肝脏疾病，影响人体正常的生理功能。病毒性肝炎、自身免疫性肝病等是困扰人类已久的肝脏疾病，多数易由急转慢，长期可发展至肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌等，因此在这类疾病的早期防治方面，阻止慢性发展过程、保护肝功能就显得十分关键和重要。虽然这类疾病诱发因素各有不同，但是目前公认异常免疫应答是这类肝病发病的重要机制之一［1-2］。因此，利用免疫反应诱导的肝损伤动物实验模型，从天然产物中寻求能显著减轻肝损伤，提高肝功能且安全性高的活性成分就具有重要的现实意义。

苹果多酚（Apple polyphenols，AP）是苹果中具有重要生物活性的一类天然多酚类物质，具有强抗氧化、清除自由基作用［3-4］，在抗癌［5-6］、抗过敏［7-8］、抑菌［9］、抗炎［10］和减肥降脂［11］等方面都表现出良好的活性。因AP具有众多活性功能和潜在的开发应用前景，其研究越来越受到人们的关注。我们前期研究已经发现AP能通过清除自由基、提高机体抗氧化能力对CCl4等所致化学性肝损伤具有显著的改善作用［12］。我们利用卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG）联合脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）方法诱导建立小鼠免疫性肝损伤模型，来研究AP对免疫性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品 AP由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供。含有多酚类物质81.29%，其中绿原酸17.08%，原花青素7.31%，根皮苷5.17%。实验时用蒸馏水配制成所需浓度。联苯双酯滴丸（Bifondate Pills，BP），浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号090701。BCG，中国生物制品检定检验所，批号：2008 -7。LPS，Sigma公司，批号103H0524。

1.2 动物 昆明种小鼠（雄性）SPF级，体质量（20± 2）g，沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK2007-004。适应性饲养2～3 d后进行实验。

1.3 仪器 美国BH13MD1600型全自动生化分析仪。瑞士L104-IC型电子天平。

1.4 动物分组、模型建立及给药 小鼠随机分为6组：溶媒对照组，模型组，阳性药联苯双酯滴丸（BP）组，AP 200、400和800 mg/kg剂量组。采用BCG结合LPS制备免疫性肝损伤模型。实验第1 d，除溶媒对照组尾静脉注射等容量生理盐水外，各组小鼠经尾静脉注射BCG 2.5 mg/0.2 mL/只。溶媒对照组和模型组灌胃蒸馏水，阳性药组灌胃BP 200 mg/kg，AP组灌胃AP 200、400或800 mg/kg，连续给药12 d。末次给药后除溶媒对照组尾静脉注射等容量生理盐水外，其他各组小鼠尾静脉注射脂多糖LPS 7.5 μg/0.2 m L/只。

1.5 血清AST，ALT，TP和Alb检测 LPS注射10 h后眶静脉丛取血，3 500 r/min离心10 min，分离血清。全自动生化分析仪测定AST、ALT、TP和Alb水平，并计算A/G值。计算方法如下。

1.6 肝指数和脾指数计算 实验末日动物称重，将动物处死，取肝和脾称重，计算肝指数和脾指数。计算方法如下。

1.7 肝脏病理学检查 取肝右小叶置于10%甲醛中，固定，HE染色，进行组织病理学检查，病理变化分级评价判断标准如下［13］：根据肝组织炎症、坏死程度，将肝组织病理改变分五级（0-Ⅳ）；“0”肝细胞形态结构正常，无损害，无坏死；“Ⅰ”有轻微变性水肿，散在炎细胞，点状坏死；“Ⅱ”肝细胞坏死呈灶状或片状，占肝小叶1/3以内，炎症细胞浸润呈灶状；“Ⅲ”肝细胞坏死呈广泛坏死，占小叶1/3～1/2，炎症浸润呈片状；“Ⅳ”肝细胞坏死占小叶1/2以上，重度炎性细胞浸润，呈片状。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验数据用（±s）表示，采用One-Way ANOVA单因素方差分析评价整体性差异，方差齐性用LSD方法进行组间比较，方差不齐用Dunnett's T3分析方法进行组间比较。病理学评分采用秩和检验进行比较。

2 结果

2.1 AP对免疫性肝损伤小鼠肝指数和脾指数的影响

与对照组相比，BCG联合LPS所致的免疫性肝损伤小鼠出现肝指数和脾指数显著升高（P＜0.01）。给药12 d后，AP 200、400和800 mg/kg均可显著抑制BCG和LPS引起的肝、脾指数的升高（P＜0.05，P＜0.01）。阳性药BP 200mg/kg同样能显著抑制BCG和LPS引起的肝、脾指数的升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1 AP对免疫性肝损伤小鼠肝指数和脾指数的影响（±s）

表1 AP对免疫性肝损伤小鼠肝指数和脾指数的影响（±s）

注：与溶媒对照组比，**P＜0.01；与模型组比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组剂量例数肝指数（%）脾指数（%）12 4.82±0.10 0.59±0.03 BCG+LPS 2.5 mg+7.5μg/只8 5.61±0.18**0.73±0.05**AP 200 mg/kg 10 5.11±0.14△0.62±0.01△400 mg/kg 8 5.17±0.15△0.63±0.02△800mg/kg 9 5.11±0.14△0.61±0.03△△BP 200 mg/kg 8 4.89±0.08△△0.58±0.03溶媒对照——△

2.2 AP对免疫性肝损伤小鼠血清AST和ALT的影响 BCG联合LPS所致的免疫性肝损伤小鼠血清中AST和ALT活性显著升高（P＜0.01），AP 800 mg/kg给药12 d后显著降低BCG联合LPS所致的免疫性肝损伤小鼠血清中升高的AST活性（P＜0.05）。阳性药BP 200 mg/kg也能使血清中异常升高的AST和ALT活性显著降低（P＜0.01，P＜0.01）。结果见表2。

表2 AP对免疫性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响（±s）

表2 AP对免疫性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响（±s）

注：与溶媒对照组比，**P＜0.01；与模型组比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组剂量例数AST（U/L）ALT（U/L）溶媒对照组——12 114.77±2.93 39.54±3.53 BCG+LPS 2.5mg+7.5μg/只12 822.83±44.87**375.00±21.76**AP 200mg/kg 10 639.50±40.53 308.89±86.96 400 mg/kg 12 645.90±34.71 321.670±93.91 800 mg/kg 11 545.36±57.54△360.38±72.47 BP 200 mg/kg 8 523.00±37.54△△160.62±13.11△△

2.3 AP对免疫性肝损伤小鼠血清TP、Alb和A/G比值的影响 与空白组相比，BCG联合LPS所致的肝损伤可以显著降低小鼠血清TP、Alb含量及A/G比值（P＜0.01），AP 200、400 mg/kg可显著升高血清中TP含量（P＜0.05），AP 400 mg/kg可显著升高血清中Alb含量（P＜0.01）。结果见表3。

表3 AP对免疫性肝损伤小鼠血清TP、Alb和A/G活性的影响（±s）

表3 AP对免疫性肝损伤小鼠血清TP、Alb和A/G活性的影响（±s）

注：与溶媒对照组比，**P＜0.01；与模型组比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

A/G溶媒对照组——分组剂量例数TP（g/L）Alb（g/L）12 63.22±0.83 40.62±0.73 1.84±0.07 BCG+LPS 2.5 mg+7.5μg/只12 50.60±1.11**30.65±0.46**1.56±0.05**AP 200mg/kg 10 54.19±1.38△32.73±1.33 1.53±0.06 400mg/kg 12 54.85±1.38△33.91±0.87△△1.63±0.04 800 mg/kg 11 51.16±0.77 32.04±0.67 1.66±0.08 BP 200 mg/kg 8 52.08±1.66 32.15±1.26 1.61±0.04

2.4 病理组织学观察 溶媒对照组病理切片光镜下观察可见肝小叶结构正常，肝细胞胞浆饱满（图1A），等级评价为0级（表4）。BCG联合LPS诱导肝损伤模型组可见肝小叶图像紊乱，结构不清楚，肝细胞嗜酸性变性，炎性细胞浸润严重，并伴有大面积点状或片状坏死（图1B），等级评价显示模型组损伤程度显著高于溶媒对照组（P＜0.01）（表4）。AP 200、400 mg/kg组可见肝组织出现不同程度凝固性坏死，炎性细胞浸润（图1C和图1D），等级评价与模型组相比无统计学意义（表4）。AP 800 mg/kg组肝小叶结构较清晰，炎性细胞浸润减少，肝细胞坏死面积减少，病变程度明显改善（图1E），等级评价较模型组有显著降低（P＜0.05）（表4）。BP 200mg/kg肝组织亦可见不同程度凝固性坏死，炎性细胞浸润（图1F）。

图1 各组小鼠代表性的肝脏HE染色图片（×400）

表4 AP对免疫性肝损伤小鼠肝组织病理评分的影响

3 讨论

病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝脏疾病严重威胁人类健康。虽然诱发病因各不相同，但研究显示活化的淋巴细胞所引起的机体异常免疫反应与病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理过程相关，机体免疫应答异常已被公认为是这类疾病发病过程的重要机制之一［1-2］。以免疫机制诱发的免疫性肝损伤动物实验模型，因能刺激T淋巴细胞活化，激活肝内免疫反应，最终导致肝细胞损伤、坏死，可以很好的模拟肝炎病症的免疫病理过程，对病毒性肝炎和自身免疫性肝病的研究具有重要意义［14］。

BCG和LPS联合作用诱导的小鼠免疫性肝损伤模型是常用的研究病毒性肝炎及保肝药物的经典动物模型［15-16］。BCG是一种减毒的活性结核杆菌疫苗，具有抗原性，但不含内毒素，毒性极弱，LPS为革兰氏阴性菌细胞壁主要成分，BCG处理后的动物对LPS十分敏感，能引发以凋亡为特点的肝细胞损伤。BCG进入体内能使T淋巴细胞致敏，激活肝中巨噬细胞-Kupffer细胞，引起Kupffer细胞的聚集和肝内浸润，此时给予低剂量LPS攻击，可激发这些致敏的细胞向肝中释放对肝细胞有毒性作用的细胞因子TNF-α、白介素等，从而激活凋亡通路、诱导氧化应激等一系列生物效应，最终导致肝损伤［17］。本文采用尾静脉注射BCG刺激12 d后LPS诱导攻击的方式制备小鼠免疫性肝损伤模型。小鼠出现肝脾指数、血清中AST和ALT活性显著增加升高，血清TP、Alb含量及A/G比值显著降低，肝细胞中度或重度炎性细胞浸润，存在点状、灶性坏死等现象，说明在我们的实验条件下成功制备了小鼠免疫性肝损伤模型。

使用此模型发现AP能显著抑制肝脾指数的升高，不同程度地减少肝功能的异常，表现为降低血清中AST活性，同时升高血清中TP和Alb的含量。对肝组织病理变化也有改善作用。本研究首次发现AP具有改善免疫性肝损伤的作用。AP是苹果中多元酚类物质的总称，主要成分包括黄酮类化合物（儿茶素、表儿茶素、根皮苷、原花青素和槲皮素等），酚酸及羟基酚酸酯（主要为绿原酸和咖啡酸）和糖类衍生物等［18］。由于AP的众多活性都与其强大的清除自由基和抗氧化作用相关［19-20］，推测AP改善免疫性肝损伤的作用也可能与其清除自由基和抗氧化作用相关。具体的机制值得深入研究。

对于病毒性肝炎和自身免疫性肝病，阻止发病过程中病程恶化，提高和改善肝功能极为重要，现有的抗病毒药物或免疫抑制剂虽可从致病原因上遏制疾病发展，但在改善肝脏病理状态，维持肝细胞结构，提高肝脏功能等方面并不具有优势，加之不同程度的不良反应，限制了使用人群。AP是从苹果皮渣中提取的天然产物，安全性高。本研究拓宽了AP保肝作用的应用范围，显示出了其良好的应用前景。

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（2013-11-12收稿 责任编辑：曹柏）

Hepatoprotective Role of App le Polyphenols against Immunological Liver Injury in M ice

Wang Fang1，2，Xue Yang1，2，Yang Jingyu1，2，Wang Huan1，2，Wu Chunfu1，2
（1 Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2 Liaoning Plant Polyphenols Research and Development Technology Research Center，Shenyang 110016，China）

Objective：To observe hepatoprotective role of apple polyphenols（AP，Appjfnol®）on immunological liver injury inmice.Methods：An immunological liver injurymodel inmicewas established by intravenous injection of Bacillus Calmette-Guerin（BCG）and lipopolysaccharide（LPS）.The liver index and spleen index，the activities of serum aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT），the levels of serum total protein（TP），albumin（Alb）and albumin/globulin（A/G）were detected.Histopathologic changewasalso investigated by HE staining.Results：AP inhibited the increases of liver index and spleen index，prevented the increase of serum AST activity and the decrease of serum TPand Alb levels.Histopathological abnormalitieswere also improved after AP adm inistration.Conclusion：AP played a significant hepatoprotective role against BCG and LPS induced immunological liver injury in mice.

Apple polyphenols；Bacillus Calmette-Guerin；Lipopolysaccharide；Immunological liver injury

R-332；R593.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.09.029

沈阳市科学技术项目计划资助（编号：F13-318-1-20）

吴春福（1952.2—），男，博士，教授，沈阳药科大学校党委书记，研究方向：天然产物活性研究，E-mail：wucf＠syphu.edu.cn，chunfuw＠gmail.com