张振燕，张美琴，吴 瑛，吴光红,*

重金属Cd与Cu在克氏原螯虾体内富集与释放规律

张振燕1,2，张美琴1,2，吴 瑛3，吴光红1,2,*

（1.江苏省水产质量检测中心，江苏 南京 210017；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；3.南京市妇幼保健院，江苏 南京 210004）

研究克氏原螯虾分别在Cd2+质量浓度为0、0.05、0.10 mg/L和Cu2+质量浓度为0、0.5、1.0 mg/L的单一水环境中暴露时，肝胰腺、鳃和肌肉对Cd和Cu的生物富集和释放特性。通过非线性拟合得到克氏原螯虾对Cd和Cu的生物富集动力学参数：富集速率常数k1、排出速率常数k2、生物富集系数（bioconcentration factors，BCF）和生物半衰期（T1/2），并得出理论富集平衡状态时生物体内Cd和Cu富集量（ρAmax）。结果表明：克氏原螯虾的肝胰腺和鳃对水体中Cd2+和Cu2+都有很强的富集特性，且富集量与富集时间、水体中Cd2+和Cu2+的质量浓度成正相关；肌肉组织中富集规律则不明显。同种重金属在不同组织中的富集量不同，即重金属富集具有组织选择性：在分别含Cd2+和Cu2+的水体中暴露实验9 d后，3 种组织对Cd的富集量顺序为鳃＞肝胰腺＞肌肉；对Cu的富集量顺序为肝胰腺＞鳃＞肌肉。克氏原螯虾对Cu和Cd的富集代谢都较缓慢，暴露9 d仍未达到稳定。克氏原螯虾体内Cd和Cu的BCF范围分别约为2～207、3～226；T1/2分别约为3～29、7～36 d；在理论平衡状态下，鳃、肝胰腺和肌肉中Cu和Cd的ρAmax随着环境中Cu2+和Cd2+质量浓度的增大而增大，且呈正相关。

克氏原螯虾；Cu；Cd；富集；释放

近年来，随着环境污染的加剧，大量重金属被排入江河湖泊中，导致水质恶化严重[1]，同时受到重金属污染的水产品通过食物链传递给食用者，对人体健康产生很大的危害。克氏原螯虾作为一种特色水产品，其重金属超标问题也逐渐受到人们的重视。重金属污染物通过鳃或者摄食过程进入虾体内，会在肝脏、肌肉、鳃和外壳等组织中呈现不同程度的富集[2-6]。研究发现，Cu和Cd等重金属产生较强的毒性效应[7]，朱玉芳等[3]发现克氏原螯虾3 种组织的超氧化物歧化酶活性受Cu、Cd的影响而降低，DNA受Cu、Cd的影响发生明显的断裂现象。孙振中等[8]在研究污染因子对克氏原螯虾的影响中指出，克氏原螯虾体内重金属残毒量受季节影响不明显，不同规格的克氏原螯虾体内重金属差异也不明显。对克氏原螯虾重金属急性毒理学实验得出克氏原螯虾对Cu2+和Cd2+的耐受力很强，Cu2+96 h半致死剂量为28.6 mg/L，Cd2+为7.73 mg/L[8]，所以研究克氏原螯虾对不同重金属的富集释放规律非常重要。

本实验研究了克氏原螯虾3 种组织在不同Cd2+、Cu2+重金属暴露质量浓度条件下的富集释放特性，可为我国克氏原螯虾的安全养殖和质量控制提供科学依据，对了解Cu、Cd在克氏原螯虾体内的分布、富集、迁移以及环境保护具有重要意义，同时为保证消费者的健康提供指导。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

克氏原螯虾，采自盱眙满江红龙虾产业科技园，体长（7.6±1.5）cm，体质量（16.5±2.5）g。实验前用养殖实验用水养殖4 d，挑选健康的克氏原螯虾作为实验动物。养殖实验用水：主要离子质量浓度为ρNa+=33 mg/L、 ρCa2+=71 mg/L、ρK+=18 mg/L、ρMg2+=15 mg/L、112 mg/L、Cd本底质量浓度3.98×10-4mg/L，Cu本底质量浓度3.38×10-3mg/L。水温（27.2±3.0）℃。养殖用实验池：水泥池尺寸为2.5 m×1.7 m×1.0 m，配有充气泵与进、出水管，实验前经清洗暴晒消毒处理，池上配有黑色遮阳膜。饲料中Cd本底含量0.11 mg/kg，Cu本底含量5.1 mg/kg。

CuSO4、CdCl2、Mg(NO3)2、NH4H2PO4、浓硝酸、双氧水均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SOLAAR M6 AA石墨炉原子吸收光谱仪 美国热电仪器公司；ETHOS1微波消解仪 意大利Milestone公司；Elix-5+Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；METTLER PL403电子天平 梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

根据国内关于重金属Cu和Cd的废水排放标准分别为1.0、0.1 mg/L，参考GB 11607—1989《国家渔业水质标准》对Cu和Cd含量的规定，设计Cu2+和Cd2+的暴露质量浓度。其中Cu2+暴露实验质量浓度分别为0.5、1.0 mg/L； Cd2+暴露实验质量浓度分别为0.05、0.10 mg/L。同时分别设空白对照组（0.0 mg/L）。

1.3.1 样品采集

本实验分为富集和释放两个阶段。实验在经过清洗和暴晒的水泥池中进行。富集过程9 d，释放过程6 d，合计15 d。富集实验开始时，每个水泥池中放入100 只经过暂养的健康克氏原螯虾，加入1 275 L含有不同重金属质量浓度的实验用水。富集实验阶段，每天上午9：00从各水泥池中随机取6 只克氏原螯虾，雌雄各半，分组织器官分别制样。第9天取样结束后将实验用水排出，清洗水泥池，同时注入普通实验用水，进入释放实验阶段，该阶段取样时间和方法与富集阶段相同。整个实验过程中，水体24 h充氧，每2 d检测水泥池内养殖水体的重金属质量浓度，如果变化明显及时换水。为减少饲料对克氏原螯虾富集重金属的影响，选择低目标重金属含量的饲料作为克氏原螯虾的食物，每天少量喂食（按克氏原螯虾每天摄食自身体质量的3%～5%计算），以维持克氏原螯虾的生长所需，经检测，实验期间饲料的影响可以忽略不计。另外，实验期间及时清除死亡的克氏原螯虾。

1.3.2 样品制备

取样后首先称质量，用清水冲洗虾体，然后用清洗过的不锈钢剪刀将虾体的腹部与头胸部分离开，剪开腹部甲壳，用不锈钢钥匙刮取肌肉，剪开并去除头胸部坚硬的外壳，用钥匙小心挑出肝胰脏，用镊子撕下两侧的腮，最终得到克氏原螯虾肌肉、肝胰脏、腮三部分组织器官样品。每池中的6 只克氏原螯虾的同一组织合并为一组混匀，分别装袋冷冻保存，待检测。

1.3.3 前处理及检测

样品前处理采用微波消解法。用电子天平准确称取待测样品0.50 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL浓硝酸、2 mL超纯水和1 mL过氧化氢，加外罐密闭后置于微波消解仪中消解，待冷却后将内罐取出，在电热板上赶酸至近干，用去离子水转移至50 mL试管中，定容至25 mL[9]，待测。克氏原螯虾样品中Cd富集量的检测方法参照GB/T 5009.15—2003《食品中Cd的测定》，Cu富集量的检测方法参照GB/T 5009.13—2003《食品中Cu的测定》。

1.3.4 实验应用模型

生物体从环境中吸收并积累污染物，其体内积累的污染物可以达到环境中的几倍甚至几万倍。目前污染物在生物体和水体中分配过程可以用双箱模型[10-11]描述，其中富集释放过程可用一级动力学过程进行描述。其主要描述如图1及式（1）～（7）所示。

图1 生物富集双箱动力学模型Fig.1 Model of two-compartment bio-concentration

其中k1为生物富集速率常数，k2为生物排出速率常数，kV为水体的挥发常数，kM为生物的代谢速率常数，ρw为水体金属质量浓度/（mg/L），ρA为生物体内重金属富集量/（mg/kg）。

在公式的推导过程中，忽略水体中重金属的自然挥发及生物体的代谢。

则由公式（2）得：

富集阶段（0＜t＜t*）

释放阶段（t＞t*）

式中：t为实验进行的时间/d；t*为富集阶段结束的时间/d；ρ0为实验开始前生物体内重金属含量/（mg/kg）。

由公式（3）、（4），通过非线性拟合得到k1、k2。理论中，富集达到平衡状态下，可以得到生物富集动力学参数，其中生物富集系数（bioconcentration factors，BCF）、生物学半衰期（T1/2）和生物体内重金属富集量（ρAmax）用公式（5）、（6）、（7）求得：

双箱动力学模型优势在于即使重金属没有达到平衡状态，也可以用来计算理论平衡状态下的重金属动力学参数。目前研究水体中重金属富集实验应用的较多，也较为成熟。

1.4 数据分析

实验所得数据用Excel 2003和Origin 8.0处理分析。

2 结果与分析

2.1 Cd在克氏原螯虾不同组织器官中的富集与释放特性

图2 克氏原螯虾不同组织器官对不同质量浓度Cd2+的富集与释放（n＝6）Fig.2 Biological accumulation and release of Cd2+at various concentrations in hepatopancreas, gill and muscle (n＝66))

由图2可知，富集阶段克氏原螯虾各组织中Cd富集量与对照组相比都有明显的增高。在肝胰腺和鳃中Cd的富集量与富集时间、暴露质量浓度成正相关，且在富集开始的1～6 d富集量增大的幅度较大，说明这段时间富集速率较快，在第7～9天Cd富集量上升比较缓慢，但仍然未达到平衡。肌肉中富集量与富集时间的关系不明显。在释放阶段，随着释放时间的延长，克氏原螯虾体内Cd的富集量明显减少，且在释放前3 d减少量幅度较大，释放的后期减少幅度较小，逐渐趋于稳定，但释放实验结束时肝胰腺和鳃中的Cd仍然处在一个较高的富集量，是实验开始时的数倍。

2.2 Cu在克氏原螯虾不同组织器官中的富集与释放特性

由图3可知，富集阶段各组织中的Cu富集量与对照组相比都有明显的增高；在肝胰腺和鳃中Cu的富集量与富集时间和暴露质量浓度成正相关；在富集开始的1～6 d Cu富集量增大的幅度较大，可以看出这段时间富集速率较快，在第7～9天富集量上升比较缓慢，但仍未达到平衡；肌肉中富集量与富集时间关系不明显。在释放阶段，随着释放时间的延长，克氏原螯虾体内Cu富集量明显减少，释放后期减少幅度较小，逐渐趋于稳定，但在释放实验结束时肝胰腺和鳃中的Cu仍然处在一个较高的富集量，是实验开始时的数倍。

图3 克氏原螯虾不同组织器官对不同质量浓C度u2+的富集与释放（n＝6）Fig.3 Biological accumulation and release of Cu2+at various concentrations in hepatopancreas, gill and muscle (n＝66))

2.3 克氏原螯虾对重金属Cd和Cu的富集与释放动力学参数

根据双箱动力学模型对克氏原螯虾肝胰腺、鳃和肌肉中Cd和Cu富集量进行非线性拟合得到动力学参数，如表1所示。

表1 克氏原螯虾各组织对不同质量浓度Cd2+和Cu2+富集释放动力学参数Table 1 Kinetic parameters of Cd and Cu in three tissues of Procambarus clarkii

由表1可知，3 种组织器官对Cd的富集速率（k1）、生物富集系数（BCF）、理论平衡状态下3 种组织器官中Cd富集量（ρAmax）的关系都是：鳃＞肝胰腺＞肌肉（P＜0.05），其中ρAmax值随着水体中Cd2+质量浓度增大而增大。3 种组织对Cd的排出速率都比较缓慢，生物半衰期（T1/2）关系为：肌肉＞肝胰腺＞鳃（P＜0.05）。同样，3 种组织器官对Cu的富集速率（k1）、BCF、理论平衡状态下3 种组织器官中Cu富集量（ρAmax）的关系总体是：肝胰腺＞鳃＞肌肉（P＜0.05），其中ρAmax值随着水体中Cu2+质量浓度增大而增大。3 种组织对Cu的排出速率没有显著差异（P＞0.05），T1/2关系为：肌肉＞肝胰腺，肌肉＞鳃（P＜0.05）。

从BCF来看，Cd在鳃中富集系数达到206.69，在肝胰腺中达到181.58；Cu在鳃中富集系数达到116.36，在肝胰腺中达到225.69，可以看出Cd、Cu在克氏原螯虾的这2 种组织中有很强的富集性，而在肌肉中的富集系数相对都较小。

3 讨 论

目前认为重金属进入水生生物体内的途径有3 条：通过滤过渗透作用由鳃进入体内、通过食物由消化道吸收进入体内和通过体表渗透进入体内，最终都进入循环系统流经全身，从而在各个组织器官内蓄积起来[12-14]。甲壳类水生动物鳃的滤过渗透作用是重金属污染物进入其体内的主要途径[3,15]。本实验中克氏原螯虾分别暴露于不同质量浓度的Cd2+和Cu2+溶液中，肝胰腺、鳃对Cd和Cu都有很强的富集能力，肌肉中有富集但是富集特性不明显。不同重金属在不同组织中的积累特性有差异，这是由于重金属在生物体内富集具有组织选择性，Cd进入克氏原螯虾体内更容易在鳃中积累，而Cu在进入克氏原螯虾体内时更易在肝胰腺中富集。李磊等[16]研究了海洋贝类对Cu、Pb的富集，结果表明，贝类对Cu有很明显的富集，且富集量随着暴露质量浓度的增大和富集时间的延长而增大，文蛤和缢蛏对Cu的富集能力大于Pb。陈海仟等[17]研究Pb和Cd在中华绒螯蟹体内的富集释放特性发现，各组织对Cd的富集表现出更强的富集能力。这主要是因为不同的生物代谢机能有差别，在同样的条件下对重金属离子的富集能力有差别，即使是同一种生物不同组织对重金属的富集也是不同的。动物体的不同组织对某种重金属具有高度的选择性：肝胰腺由于可以迅速地合成金属硫蛋白，因此可以使重金属大量积累；鳃表面积大，其结合位点多，同时也是金属硫蛋白合成的主要场所之一[18]，所以鳃也可以使重金属大量积累。重金属污染物进入生物体内首先在鳃表面附着通过结合位点结合进入体内，然后在内脏器官中与金属硫蛋白结合蓄积起来，只有在鳃或者内脏器官中过渡积累才会有一部分随着循环系统进入到肌肉中，所以肌肉不会表现出明显的富集特性。

在释放阶段，克氏原螯虾各组织对Cd、Cu的排出情况不同，其中肝胰腺和鳃对它们有明显的排出，而肌肉中则不明显。Cd、Cu在肌肉中的生物半衰期要比鳃和肝胰腺中的生物半衰期长，这是由于Cd、Cu在进入克氏原螯虾体内后首先在肝胰腺和鳃中富集，经过代谢机制的物质交换其中一小部分重金属进入肌肉中富集起来，但是重金属一旦进入肌肉就很难再代谢排出，而内脏和鳃是水生生物主要的解毒和排泄器官[18]，所以Cd、Cu在肌肉中的生物半衰期较其他组织要长。克氏原螯虾的这一机制，使得重金属污染物大量的积累于肝胰腺和鳃，可食部分肌肉的安全性提高，所以在食用克氏原螯虾时建议去掉头胸部。

4 结 论

在本实验中，克氏原螯虾分别暴露于不同质量浓度的Cd2+、Cu2+溶液中时，克氏原螯虾对水体中Cd和Cu都有很强的富集特性，对Cd和Cu的BCF范围分别约为2～207和3～226。富集量与富集时间和重金属暴露质量浓度成正相关。重金属的富集具有组织选择性，在相同质量浓度Cd2+水体中暴露时，富集量：鳃＞肝胰腺＞肌肉；在相同质量浓度Cu2+水体中暴露时，富集量：肝胰腺＞鳃＞肌肉。肌肉对重金属富集能力相对于肝胰腺和鳃较弱，在富集9 d后肌肉中富集量变化不大，所以肌肉的食用安全性较高。克氏原螯虾在释放实验6 d以后肝胰腺和鳃中Cu和Cd中的富集量仍然高出初始值的数倍。对于受到重金属污染的克氏原螯虾，即使清水中养殖一段时间也不能保证体内重金属释放，所以在食用克氏原螯虾时建议去掉头胸部。本实验有助于进一步了解重金属在克氏原螯虾体内的分布和迁移，为克氏原螯虾的科学养殖和重金属安全控制提供了科学依据。

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Biological Accumulation and Release of Cd and Cu in Procambarus clarkii

ZHANG Zhen-yan1,2, ZHANG Mei-qin1,2, WU Ying3, WU Guang-hong1,2,*
(1. Fishery Analysis and Testing Center of Jiangsu Province, Nanjing 210017, China; 2. Freshwater Fisheries Research Institute of Jiangsu Province, Nanjing 210017, China; 3. Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital, Nanjing 210004, China)

Biological accumulation and release of the two heavy metals Cd and Cu in gill, hepatopancreas and muscle of Procambarus clarkii were studied with initial Cd2+concentrations of 0, 0.05 and 0.10 mg/L, and initial Cu2+concentrations of 0, 0.5 and 1.0 mg/L, respectively. Kinetic parameters such as heavy metal uptake rate constant (k1), extraction rate constant (k2), bio-concentration factor (BCF) and biological half-life (T1/2) and equilibrium concentration (ρAmax) in vivo of the heavy metals were obtained by non-linear curve fitting. The results showed that obvious accumulation of Cd and Cu was observed in Procambarus clarkii and the concentrations of heavy metals in gill, hepatopancreas, and muscle exhibited an apparent positive correlation between accumulation time and exposure concentrations. But the concentrations of both heavy metals revealed different levels in different tissues following the decreasing order: hepatopancreas ＞ gill ＞ muscle for Cd, and gill ＞ hepatopancreas ＞ muscle for Cu. The maximal heavy metal contents (ρAmax) in gill, hepatopancreas and muscle were positively correlated to the exposure concentration. The BCF of Cd and Cu in the tissues ranged from 2 to 207 and from 3 to 226, respectively. The T1/2of Cd and Cu in the tissues ranged from 3 to 29 d and from 7 to 36 d, respectively.

Procambarus clarkii; Cu; Cd; accumulation; release

TS207.3

A

1002-6630（2014）17-0250-05

10.7506/spkx1002-6630-201417048

2013-11-18

江苏省农业科技自主创新项目（CX（13）3095）；农业部公益性行业（农业）科研专项（201003070）

张振燕（1986—），女，硕士，研究方向为食品安全。E-mail：zyzhang1986@126.com

*通信作者：吴光红（1956—），男，研究员，博士，研究方向为水产质量安全。E-mail：ghwu2007@163.com