张红霞，杨丹丹，王 凤，李伊娇，范俊峰

杜仲叶乙醇提取物的降糖作用机理

张红霞，杨丹丹，王 凤，李伊娇，范俊峰*

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

为了阐明杜仲叶的降血糖功效及其机制，采用酶-抑制剂模型，筛选高抑制率的杜仲叶乙醇提取物并判断其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型；借助Caco-2人结肠腺癌细胞模型，研究杜仲叶20%乙醇解吸物对α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖转运蛋白的影响；气相色谱-质谱联用分析杜仲叶20%乙醇解吸物主要成分。杜仲叶20%乙醇解吸物可竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶，其抑制常数Ki值为32.90 mg/mL。它对Caco-2细胞中的α-葡萄糖苷酶有较强抑制作用，其IC50为0.57 mg/mL，且对Caco-2细胞摄取葡萄糖也有一定抑制作用，1 mg/mL时抑制率可达26.25%。气相色谱-质谱分析表明杜仲叶20%乙醇解吸物主要有DL-异柠檬酸内酯、百里酚、儿茶素、2,6-二羟基-苯甲酸和3,4-二羟基-苯丙烯酸等。这些结果表明，杜仲叶乙醇提取物可以通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低葡萄糖吸收来实现降血糖的效果。

杜仲叶；Caco-2细胞；α-葡萄糖苷酶；降血糖；葡萄糖转运；儿茶素

糖尿病已被列为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大致死性疾病[1]。碳水化合物在人体内必须经由α-葡萄糖苷酶水解其α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、果糖、半乳糖后才能被小肠吸收。因此通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，可延迟或阻碍多糖在消化道内水解，以降低人体血糖浓度，可有效防治糖尿病[2-3]。α-葡萄糖苷酶抑制剂，已第3次被亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂越来越成为近年来药物化学的研究热点[4]。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是药理性质很强的中药材，杜仲有降血压、提高免疫力、抗衰老、补肾、强筋健骨等作用[5-6]。同时，杜仲也是中国传统的药食同用的保健食品，以杜仲鲜叶为原料炮制而成的杜仲茶可减少体内多余脂肪和胆固醇[7]，在东亚非常流行。杜仲制成的杜仲晶、杜仲粉等都有一定的保健功效[8-9]。最近研究表明杜仲叶具有降血糖作用[7]，杜仲分离得到的黄酮醇糖苷可抑制糖化作用，作用可以与氨基呱相媲美[10]；杜仲叶水提物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠有一定的降血糖作用[11]；杜仲茶甲醇抽提物可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，维持体内适当的血糖值[12]。但是，目前对杜仲叶降血糖的研究大多停留在化学成分分析、降糖效果上，针对其在人体内降血糖机制尚不清楚。

本实验借助Caco-2人结肠腺癌细胞模拟人体小肠壁环境，从肠道二糖酶系活性以及葡萄糖吸收的角度出发，研究了杜仲叶20%乙醇解吸物降血糖机制。本实验首先对杜仲叶乙醇提取物（ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves，EE）进行分离纯化，并以酶-抑制剂为模型通过酶促反应动力学研究，判断杜仲叶20%乙醇解吸物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型及亲和度；然后借助Caco-2细胞模型，研究了杜仲叶20%乙醇解吸物的降糖作用，并初步探讨其作用机制；最后利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）对杜仲叶20%乙醇解吸物主要降糖成分进行分析。本实验可以从糖的消化转运途径阐明杜仲叶降血糖保健功效的原理，为进一步生产杜仲叶降血糖保健品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杜仲叶采集自陕西汉中略阳县。

大孔树脂（A B-8） 天津市南开大学化工厂；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、噻唑蓝（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美国Sigma公司；Caco-2细胞 北京协和医院；MEM培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；96孔培养板、24孔培养板、细胞培养瓶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胰蛋白酶 美国HyClone公司；阿卡波糖 拜耳医药保健有限公司；麦芽糖（分析纯） 北京化工厂；葡萄糖试剂盒 上海超研试剂有限公司；N,O-双（ 三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）、三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）上海安普仪器试剂公司。

1.2 仪器与设备

LL-1500真空冷冻干燥机 赛默飞世尔科技有限公司；GC/MS-QP2010A气质联用仪 日本岛津公司；CO2细胞培养箱 日本Yamato公司；超净工作台 苏州医疗器械仪器厂；ST-360酶标仪 上海科华实验系统有限公司；倒置显微镜 日本Olympuse公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲叶乙醇提取物的提取及纯化

杜仲叶洗净烘干粉碎，过20 目筛，40%乙醇溶液为提取液，料液比1∶60（m/V），浸泡2.5 h后，每次超声提取1 h，重复提取2 次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩后冷冻干燥，备用[13]。

将所得样品配制为质量浓度5 mg/mL，共100 mL的EE溶液。使用AB-8大孔树脂装入2.0 cm×40 cm玻璃色谱柱，柱床体积60 mL进行分离纯化。首先，吸附过程中调节流速为1.0 mL/min，直到提取液完全进入树脂层；充分吸附后依次使用200 mL的0、20%、40%、60%、80%乙醇溶液以2.0 mL/min流速进行洗脱，收集解吸液，分别为EEA、EEB、EEC、EED、EEE，浓缩后冷冻干燥，备用[14]。具体的提取分离流程如图1所示。

图1 杜仲叶活性成分提取分离流程Fig.1 Extraction and separation of bioactive components from Eucommia ulmoides leaves

1.3.2 杜仲叶乙醇提取物对酶-抑制剂模型的α-葡萄糖苷酶的抑制作用

在96 孔酶标板上，每个样品做3 个平行实验，在每个孔中先后加入120 μL 0.5 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.7），20 μL一定质量浓度的杜仲叶乙醇提取物，50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（25 mg/mL）和50 μL PNPG（3 mmol/L），混匀后37 ℃反应1 h，然后加入50 μL碳酸钠溶液（0.67 mol/L）终止反应，最后在405 nm波长处用酶标仪测定吸光度[15]。按公式（1）计算酶活性抑制率。

式中：A1为空白组吸光度，20 μL的去离子水代替提取液；A2为实验组吸光度；A3为背景组吸光度，只加入提取物，以100 μL磷酸缓冲液代替α-葡萄糖苷酶及PNPG。

1.3.3 EEB对α-葡萄糖苷酶抑制的动力学实验

选定质量浓度为10、20 mg/mL的EEB，分别加入浓度（[S]）为1、3、6、9、12 mmol/L的PNPG，按照1.3.2节方法作出不同浓度的PNPG吸光度A随时间t变化图，并以直线部分求速率V，同时测定不加抑制剂时不同浓度PNPG的反应速率[16]。按Lineweaver-Burk 作图，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，分别绘制不同浓度EEB的抑制作用动力学曲线，求出米氏常数Km并根据竞争性抑制动力学方程（2），确定抑制常数Ki值。

1.3.4 EEB的细胞毒性实验

采用MTT法，选择EEB对Caco-2细胞的安全质量浓度。将细胞悬液稀释为3×104个/mL，混匀后每孔100 μL接种于96 孔板上，37 ℃、5% CO2环境中孵育24 h，弃上清液，贴壁细胞用于实验，每孔加入含EEB的完全培养基（对照孔只加完全培养基）100 μL，培养48 h后检测细胞增殖情况。加MTT（5 mg/mL）每孔20 μL，置37 ℃、5% CO2环境中孵育5 h，弃上清液，加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）每孔200 μL，避光振荡15 min，于酶标仪570 nm波长处测定吸光度[17]。

1.3.5 EEB对Caco-2细胞模型α-葡萄糖苷酶活性的抑制

实验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组、实验组，Caco-2细胞接种于24 孔板上（4×104个/mL），培养至12 d。实验前弃去培养液，细胞用PBS洗3 次，除去细胞表面附着物。空白组每孔加入l mL PBS；阴性对照组每孔加入800 μL 28 mmol/L麦芽糖溶液和200 μL PBS；阳性对照组每孔加入800 μL 28 mmol/L麦芽糖溶液和200 μL阿卡波糖溶液，使阿卡波糖终质量浓度为0.20 mg/mL；实验组每孔加入800 μL 28 mmol/L麦芽糖溶液和200 μL EEB，使EEB终质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL；置37 ℃反应40 min后移入冰浴，迅速吸出反应液50 μL，分别加入200 μL的葡萄糖试剂盒中，37 ℃反应30 min，在490 nm波长处测定吸光度A并记录，计算抑制率及IC[18-19]。50

酶活力单位定义：每分钟分解1.0 μmol/L底物为一个酶活力单位[20]。按公式（3）计算二糖酶活力。

式中：c为反应所释放的葡萄糖浓度/（μmol/L）；N为样品稀释倍数；t为反应时间/min；B为1个单位的二糖分解后葡萄糖释放量（即麦芽糖B为2）。

1.3.6 EEB对Caco-2细胞模型葡萄糖吸收的影响

实验在24 孔板的单层细胞上进行。实验前弃去培养液，细胞用PBS洗3 次，除去细胞表面附着物。加入含EEB的PBS 0.4 mL，置37 ℃孵育10 min后加入0.55 mmol/L的葡萄糖溶液1.6 mL，使EEB终质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL；空白组以0.4 mL PBS代替含EEB的溶液。37 ℃培养箱中培养40 min，迅速吸出溶液，用冰冷（4 ℃）PBS洗细胞3 次，收集细胞，反复冻融破碎，分别测定细胞中葡萄糖及蛋白质含量[21]。细胞葡萄糖含量测定采用氧化酶-葡萄糖试剂盒法；细胞蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[22]。

1.3.7 EEB成分分析

取干燥样品EEB置于安培瓶中，无水分残留，否则会影响衍生化的效果。以1∶1（V/V）的比例加入衍生化试剂，含0.1% TMCS的BSTFA，将安培瓶口封好，超声波处理1 h，放入100 ℃的烘箱中加热，取出后冷却至室温。

气相色谱检测条件：进样量为1 μL，分流进样，分流比30∶1；Rtx-5毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；程序升温柱温设置：柱初温50 ℃，升温速率6 ℃/min，升至250 ℃，继续升温，速率15 ℃/min，升至280 ℃，保持时间不少于10 min；接口温度250 ℃，进样口温度270 ℃。质谱条件：EI离子源温度220 ℃，电离电压70 eV，倍增器电压350 V，扫描范围33～500 amu，扫描速率0.5 s/次[23-24]。

1.4 数据处理

实验最少重复3 次取平均值，表示为x±s，所有数据用SPSS 20.0软件处理，用Duncan’s法进行方差分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

图2 大孔树脂分离纯化后各成分对α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.2 Anti-α-glucosidase activity of the fractions separated from the 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves by macroporous resin adsorption

经大孔树脂动态纯化后的杜仲叶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，由图2可知，EEB对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，为（43.08±0.55）%；其次是EEC，（26.74±0.32）%，比EEA高1.14%；而EED抑制率只有（13.87±0.20）%，是5 个组分中最低的。

2.2 EEB对α-葡萄糖苷酶抑制动力学

图3 EEB的Lineweaver-Burk的双倒数曲线Fig.3 Lineweaver-Burk curve of EEB

由图3可知，最大反应速率（Vmax）随着抑制剂质量浓度的增大保持不变，米氏常数（Km）增大，说明了EEB对α-葡萄糖苷酶底物在该酶上的络合位点相同，互相竞争，属竞争性抑制剂。根据竞争性抑制动力学方程1/Km’=1/{Km（1+[I]/Ki）}，从图3中求得EEB质量浓度为10、20 mg/mL时Km’，再根据α-葡萄糖苷酶的Km和Vmax，可求出EEB质量浓度为10、20 mg/mL时Ki的均值为32.90 mg/mL。

2.3 EEB的细胞毒性实验

图4 不同质量浓度EEB对Caco-2细胞生长的影响Fig.4 Effect of EEB on the growth of Caco-2 cells

由图4可知，在0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL条件下吸光度A570nm分别为0.818±0.046、0.849±0.015、0.849±0.033、0.783±0.053、0.767±0.118、0.774±0.037。实验组与空白组无显著差异（P＞0.05）。这说明实验质量浓度下，EEB对Caco-2细胞无明显毒性。

2.4 Caco-2细胞中EEB的降血糖机制

2.4.1 EEB对Caco-2细胞模型的α-葡萄糖苷酶抑制作用

图5 EEB对α-葡萄糖苷酶酶活性的抑制作用Fig.5 Anti-α-glucosidase activity of EEB in Caco-2 cells

如图5所示，EEB在以麦芽糖为底物时对Caco-2细胞中α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。当EEB质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL时，抑制率分别为（19.50±1.93）%、（32.07±1.08）%、（44.21±3.34）%、（49.11±3.78）%、（51.75±2.15）%。其IC50值为0.57 mg/mL。随着EEB质量浓度的升高，α-葡萄糖苷酶活性逐渐降低，说明其抑制α-葡萄糖苷酶活性具有质量浓度依赖性。

2.4.2 EEB对Caco-2细胞模型葡萄糖吸收的影响

图6 EEB对Caco-2细胞的葡萄糖吸收抑制作用Fig.6 Anti-absorption of glucose of EEB in Caco-2 cells

如图6所示，空白组中葡萄糖吸收量为3.018 μmol/mg；添加EEB的实验组中，Caco-2细胞对葡萄糖吸收量出现一定程度的降低。随着EEB质量浓度的上升，抑制率逐渐上升。这说明EEB对Caco-2细胞模型葡萄糖吸收有一定的抑制作用，1 mg/mL时抑制率为（26.25±0.86）%。

2.5 EEB硅烷化衍生物GC-MS分析

EEB的GC-MS总离子流图如图7所示。其中一部分化合物由于含量少或者无法衍生化为挥发性物质，故无法确定其化学结构，也有一部分为杂峰，予以扣除后通过标准质谱库检索和人工解吸相结合，分析EEB中主要降血糖成分，结果见表1。

图7 EEB的总离子流图Fig.7 TIC profileof EEB

表1 EEB中抑制-葡萄糖苷酶成分的相对含量Table 1 Relative contents of -glucosidase inhibitors in EEB

由表1可知，EEB主要以内酯类、有机酸、酚类、单糖类、醇类、氨基酸为主。除此之外，还有核苷、醚类、胺类、烯烃类化合物。

EEB成分中含有的内酯类化合物相对含量最高，为16.75%。这其中DL-异柠檬酸内酯的相对含量最高，达到了13.79%，其次为D-甘露糖酸-1,4-内酯（0.73%），D-葡萄糖酸-1,4-内酯（2.23%）。EEB成分中含有的有机酸种类最多，包含饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸以及芳香族脂肪酸。饱和脂肪酸中主要含有草酸（0.95%）、乳酸（0.57%）等；不饱和脂肪酸主要含有2-酮-D-葡萄糖酸（2.63%）、10,12-二十二碳二炔二酸（1.42%）（表中未列出）等；芳香族脂肪酸中2,6-二羟基-苯甲酸含量较高，为2.11%。酚类化合物总相对含量为4.36%，分别为百里酚（0.67%），邻羟基苯乙醇（0.46%），3,4-二羟基-苯丙烯酸（1.9%），儿茶素（0.88%），4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇（0.45%）。EEB还检测到左旋葡聚糖（0.62%）、阿拉伯呋喃糖（1.46%）、呋喃半乳糖（1.81%）、吡喃葡萄糖（3.09%）、吡喃甘露糖（2.37%）、D-岩藻糖（0.65%）等单糖类化合物。就氨基酸而言，5-氧代脯氨酸相对含量为0.54%；4-羟基脯氨酸相对含量为1.25%。醇类物质而言，3,4-双脱氧己糖醇相对含量为0.54%；桃金娘烯醇为0.54%。此外，EEB中还含有0.7%甲酚甘油醚；0.77%苯胺羰酸；0.45% VB6等物质。

3 讨 论

小肠绒毛壁上皮的二糖酶系丰富，可引起餐后血糖升高，其中最重要的是α-葡萄糖苷酶[25]。本实验发现，杜仲叶20%乙醇解吸物（EEB）有很强的体外抗α-葡萄糖苷酶活性，并且EEB与α-葡萄糖苷酶有较高的亲和性（Ki值为32.90 mg/mL）。进一步的实验结果表明，EEB对于Caco-2细胞中α-葡萄糖苷酶活性也具有较强抑制作用，并且可以抑制Caco-2细胞对葡萄糖的吸收。GC-MS分析表明，杜仲叶EEB含有重要的抗α-葡萄糖苷酶成分，包括百里酚、儿茶素、2,6-二羟基-苯甲酸、3,4-二羟基-苯丙烯酸和DL-异柠檬酸内酯等成分，含量最高可达13.79%。

正常人进食后，食物中的碳水化合物如淀粉先在α-淀粉酶作用下生成麦芽糖、麦芽三糖等，随后经α-葡萄糖苷酶水解作用生成葡萄糖等，经肠壁细胞吸收而被机体利用。因此抑制α-葡萄糖苷酶活性，阻碍二糖进一步分解对于延缓餐后血糖值升高有着重要作用。现在研究多采用PNPG为底物的酶-抑制剂模型，筛选强活性的α-葡萄糖苷酶抑制剂。但是这种模型无法直接评价筛选得到的降糖物质在体内的药效作用，存在假阳性率高、体内外活性差异较大、临床效果不理想等弊端[26]。因此本实验在采用PNPG为底物的酶-抑制剂模型基础上，借助Caco-2细胞模拟人体小肠壁环境，克服了体内外活性差异大等缺点，并在此基础上研究了EEB降血糖机制。Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，体外培养达到融合后，可自然分化为与成熟小肠细胞具备类似形态和生化特性的细胞。目前Caco-2细胞主要用于药物吸收转运机制研究，可表现出与人小肠上皮细胞相似的与糖消化、吸收有关的酶以及蛋白质[27]。故可借助Caco-2细胞所表达的α-葡萄糖苷酶构建模型来研究EEB对α-葡萄糖苷酶的作用。

首先在酶-抑制剂模型中，EEB抑制率最高，为（43.08±0.55）%。其次酶促反应动力学研究发现，EEB对α-葡萄糖苷酶抑制类型为竞争性抑制且Ki值仅为32.90 mg/mL，这说明EEB与α-葡萄糖苷酶有很高的亲和性。之后进一步利用Caco-2细胞模型发现，EEB以麦芽糖为底物时对细胞内α-葡萄糖苷酶有较强抑制率。EEB抑制α-葡萄糖苷酶活性随着EEB质量浓度升高而升高，IC50值为0.57 mg/mL。对比常用降血糖药物-阿卡波糖在0.20 mg/mL时对α-葡萄糖苷酶活性抑制率为67.92%，同等质量浓度的杜仲叶乙醇提取物抑制率达到了57.57%。

葡萄糖吸收过程中主要涉及钠葡萄糖共转运载体1（sodium/glucose cotransporter-1，SGLT-1）、葡萄糖协助扩散转运载体2（glucose transporter 2，GLUT-2）两种跨膜转运载体蛋白[28]。其中位于小肠细胞黏膜表面上的SGLT-1起主导作用，其在细胞基底膜Na+-K+-ATP酶作用下逆Na+浓度差，消耗能量，主动转运葡萄糖[29-30]。因此，肠道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT-1、GLUT-2和Na+-K+-ATP酶共3 种蛋白。Caco-2细胞模型中，EEB除可抑制α-葡萄糖苷酶活性外还可抑制葡萄糖摄取吸收，1.00 mg/mL时抑制率26.25%。针对EEB抑制Caco-2细胞中葡萄糖吸收的具体机制尚不清楚。但研究表明，茶叶提取物可通过竞争性抑制Caco-2细胞膜上SGLT-1、GLUT-2、GLUT-5等葡萄糖转运蛋白的活性来抑制细胞对于葡萄糖的吸收[31]。夏枯草提取物可能通过抑制SGLT-1、GLUT-2及Na+-K+-ATP酶在mRNA水平上的表达，抑制转运蛋白生成量，从而降低葡萄糖吸收量[32]。因此，EEB可能通过抑制葡萄糖转运蛋白的活性或者抑制葡萄糖转运蛋白在mRNA水平上的表达，从而实现对葡萄糖吸收的抑制。

在本实验基础上，可通过继续实验研究在Caco-2细胞模型上EEB对于蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖等其他二糖酶的抑制效果，研究其对葡萄糖转运蛋白的影响，以便于进一步研究EEB的降血糖机制。综上可得，EEB可通过抑制α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖吸收，起到降血糖的效果。

药用植物中，具备抗α-葡萄糖苷酶活性的有效成分主要由多酚、黄酮及黄酮苷、生物碱、三萜及其苷类、肽类、酯类、酸类等组成[33]。GC-MS分析EEB主要成分含有酸类、单糖类、多酚、酯类、氨基酸等物质。有研究发现，利用高效液相色谱法分离杜仲茶甲醇提取物可得到5 种α-葡萄糖苷酶抑制剂分别为：槲皮素、儿茶素-α（7,8-b.c）-4d-（3,4-二羟基）-α（3H）吡喃糖、儿茶素-α（7,8-b.c）-4β-（3,4-二羟基）-α（3H）葡萄糖、山奈酚α-3-O-β-葡萄糖和杜仲醇[9]。本实验分析得到了儿茶素，含量为0.88%。由于提取分离杜仲叶方法不同，并未检测到槲皮素、山奈酚α-3-O-β-葡萄糖和杜仲醇。但是，EEB中的其他成分可能具备抑制α-葡萄糖苷酶的活性。桂花中的脂肪酸具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性[34]。EEB成分中含有有机酸的种类最多，包含10 种饱和脂肪酸，6 种不饱和脂肪酸以及3 种芳香族脂肪酸。其中不饱和脂肪酸含量最高，达6.86%。杜仲多糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降血糖作用[35]。苦瓜多糖和芦荟多糖都有降血糖的作用，而苦瓜多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖等构成；芦荟多糖以甘露糖、阿拉伯糖等构成[36]。本实验发现EEB含有的单糖类化合物相对含量为13.25%，其中吡喃甘露糖含量相对较高，为2.37%；阿拉伯呋喃糖含量为1.46%；呋喃半乳糖为1.81%。茶多酚对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性且延缓小肠对糖的消化吸收起到降糖作用[37]。EEB中儿茶素含量为0.88%。除此，EEB中还检测到百里酚、3,4-二羟基-苯丙烯酸、4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇等酚类物质。海带中提取得到的D-甘露醇与丙酮合成的二异亚丙基甘露醇可抑制α-葡萄糖苷酶活性[38]。EEB中可分离得到5 种醇类成分（3.27%）。EEB中内酯类化合物的相对含量最高，为16.75%，其中DL-异柠檬酸内酯的相对含量最高，达到了13.79%。此外，EEB中还检测出2 种氨基酸（1.79%），分别为5-氧代脯氨酸和4-羟基脯氨酸。L-羟基脯氨酸能使正常小鼠进食量明显增加时而不增加体质量增长速率，减少营养性肥胖模型大鼠的体质量[39]。根据以上成分结构鉴定，本实验发现EEB含有儿茶素、百里酚、吡喃甘露糖、2,6-二羟基-苯甲酸，3,4-二羟基- 苯丙烯酸和DL-异柠檬酸内酯等成分，含量最高可达13.79%。推测这些成分可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，为测定其在杜仲叶中的含量以及进一步研究它们对α-葡萄糖苷酶的抑制作用奠定了基础。

4 结 论

本实验发现，杜仲叶乙醇提取物降血糖效果主要是通过抑制α-葡萄糖苷酶活力，减少葡萄糖吸收，降低餐后高血糖实现的。本实验从糖的消化转运途径阐明了杜仲叶降血糖保健功效的原理，为杜仲叶治疗糖尿病的开发利用打下了理论基础。

[1] 王华. 糖尿病药物治疗的研究进展[J]. 临床合理用药杂志, 2010, 3(3): 123-124.

[2] 季芳, 肖国春, 董莉, 等. 药用植物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(12): 1633-1640.

[3] 李玉萍, 白冰, 叶军, 等. α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备和活性研究进展[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 617-620.

[4] KRENTZ A J, BAILEY C J. Oral antidiabetic agents current role in type 2 diabetes[J]. Drugs, 2005, 65(3): 385-411.

[5] 彭红梅, 李小姝. 杜仲的药理研究现状及应用展望[J]. 中医学报, 2013, 28(1): 72-73.

[6] 晏媛, 郭丹. 杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展[J]. 中成药, 2003, 25(6): 491-492.

[7] 李跃中, 陈怡平. UHPE-HPLC法测定杜仲茶中桃叶珊瑚甙的含量[J].中国卫生检验杂志, 2007, 17(12): 2203-2204.

[8] 宗留香, 康怀斌, 毛薇, 等. 杜仲保健面条的研制[J]. 食品科技, 2003, 28(3): 80-81.

[9] 刘亮, 卢琪, 段加彩, 等. 杜仲茶酸奶的研制及茶粉、绿原酸对酸奶品质的影响[J]. 食品科学, 2010, 31(12): 114-118.

[10] KIM H Y, MOON B H, LEE H J, et al. Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides O. with glycation inhibitory activity[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 93(2/3): 227-230.

[11] LEE M K, KIM M J, CHO S Y, et al. Hypoglycemic effect of Duzhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 2005, 67(1): 22-28.

[12] WATANABE J, KAWWABATA J, KURIHARA, et al. Isolation and identification of α-glucosidase inhibitors from tochu-cha (Eucommia ulmoides)[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1997, 61(1): 177-178.

[13] 贾正, 黄文, 薛安. 杜仲叶黄酮的超声提取及其抗氧化性研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(4): 1286-1288.

[14] 刘志祥, 曾超珍, 张玥. AB-8大孔树脂分离纯化枸骨叶总黄酮的工艺研究[J]. 食品科学, 2010, 31(12): 76-79.

[15] ZHU Yunping,YIN Lijun, CHENG Yongqiang, et al. Effects of sources of carbon and nitrogen on production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2[J]. Food Chemistry, 2008, 109(4): 737-742.

[16] 马庆一, 陈丽华, 杨海延, 等. 山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制活性因子的筛选(Ⅰ)[J]. 食品科学, 2007, 28(1): 167-170.

[17] 王立平. 瑞士乳杆菌酪蛋白源活性肽制备及其生理功效研究[D]. 北京: 北京林业大学, 2008.

[18] 马庆一, 陈丽华, 杨海延, 等. 山茱萸中α-葡萄糖苷酶抑制活性因子的筛选(Ⅱ)[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 73-78.

[19] OGAWA N, SATSU H , WATANABE H, et al. Acetic acid suppresses the increase in disaccharidase activity that occurs during culture of Caco-2 cells[J]. The Journal of Nutrition, 2000, 130(3): 507-513.

[20] 许梓荣, 李卫芬, 孙建义. 猪胃肠道黏膜二糖酶的性质[J]. 动物学报, 2002, 48(2): 202-207.

[21] 潘国宇, 王广基, 孙建国, 等. 小檗碱对葡萄糖吸收的抑制作用[J].药学学报, 2003, 38(2): 911-914.

[22] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

[23] 刘振华, 王如伟, 何厚洪, 等. 三甲基硅烷衍生化GC-MS 研究延胡索中水溶性非生物碱类化学成分[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(14): 2108-2112.

[24] ZHOU Yiqi, WANG Zijian, JIA Ning. Formation of multiple trimethylsilyl derivatives in the derivatization of 17-ethinylestradiol with BSTFA or MSTFA followed by gas chromatography-mass spectrometry determination[J]. Journal of Environmental Science, 2007, 19(7): 879-884.

[25] 吴涛, 郑娟, 张程亮, 等. 中药肠吸收的研究进展[J]. 药物与临床, 2013, 10(6): 30-35.

[26] 吴酬飞, 许杨, 李燕萍. α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究进展[J].国际药学研究杂志, 2008, 35(1): 9-12.

[27] 杨秀伟, 杨晓达, 王莹, 等. 中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作规程的建立[J]. 中西医结合学报, 2007, 5(6): 634-641.

[28] GOULD G W, HOLMAN G D. The glucose transporter family: structure, function and tissue-specific expression[J]. Biochemical Journal, 1993, 295(Pt 2): 329-341.

[29] JOOST H G, WANDEL S, SCHURMANN A. Structure function relationship of glucose transporters catalyzing facilitated diffusion[J]. Experimental and Clinical Endocrinology, 1994, 102(6): 434-438.

[30] DYER J , DALY K, SALMON K S H, et al. Intestinal glucose sensing and regulation of intestinal glucose absorption[J]. Biochemical Society Transactions, 2007, 35(5): 1191-1194.

[31] SHIMIZU M, KOBAYASHI Y, SUZUKI M, et al. Regulation of intestinal glucose transport by tea catechins[J]. Biofactors, 2000, 13(1/4): 61-65.

[32] 吴慧平, 哈团柱, 郜明. 夏枯草提取物对Caco-2细胞α-葡萄糖苷酶、SGLT-1、GLUT-2、Na+-K+-ATP酶mRNA表达的影响[J]. 中国生化药物杂志, 2010, 31(6): 373-376.

[33] ROBLEDO S, OSORIO E, MUÑOZ D, et al. in vitro and in vivo cytotoxicities and antileishmanial activities of thymol and hemisynthetic derivatives[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(4): 1652-1655.

[34] 陈百泉, 王金梅, 苑鹏飞, 等. 4种桂花脂肪酸成分及α-葡萄糖苷酶抑制作用[J]. 精细化工, 2009(12): 1188-1191.

[35] 刘国荣, 邱立朋, 周延萌, 等. 杜仲多糖对糖尿病小鼠降血糖作用及其机制研究[J]. 泰山医学院学报, 2010, 31(9): 659-661.

[36] 崔旻. 苦瓜多糖和芦荟多糖的降血糖作用及其机理的研究[D]. 济南: 山东师范大学, 2003.

[37] 杨冯, 赵国华. 茶多酚降血糖研究进展[J]. 食品工业科技, 2009, 30(9): 324-327.

[38] 詹天荣, 郑立, 陈海敏, 等. 二异亚丙基甘露醇的合成及其抑菌和抑制葡萄糖苷酶活性[J]. 海洋与湖沼, 2003, 34(5): 572-576.

[39] 贾晓波, 庞会从, 赵瑞芹. L-羟脯氨酸用于减肥的实验研究[J]. 中国药科大学学报, 2003, 34(3): 276-278.

Ethanol Extract of Eucommia ulmoides Leaves Inhibits Alpha-Glucosidase in Caco-2 Cells

ZHANG Hong-xia, YANG Dan-dan, WANG Feng, LI Yi-jiao, FAN Jun-feng*
(College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

The inhibitory effects of 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves on alpha-glucosidase and glucose transport were investigated in Caco-2 cells in vitro to elucidate the anti-hyperglycemic mechanism of Eucommia ulmoides leaves. The alpha-glucosidase inhibitors in the ethanol extract were also identified by GC-MS analysis. The kinetic study showed that the 20% ethanol elution fraction (EEB) from macroporous resin AB-8 of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves could competitively inhibit alpha-glucosidase with a Kivalue of 32.90 mg/mL, indicating that alphaglucosidase has a strong affinity with the extract. Meanwhile, the inhibition was found to be reinforced as the concentration of EEB increased. For investigation of the inhibitory effect of EEB in Caco-2 cells, cytotoxicity assays were firstly conducted by using different concentrations of EEB (0.05, 0.10, 0.20, 0.50 and 1.00 mg/mL) to determine the safety level at which cell growth and viability could not be affected. All tested concentrations of EEB had no effect on the growth or viability of Caco-2 cells. Subsequently, EEB at various concentration exhibited effective suppression on alpha-glucosidase by using maltose (28 mmol/L) as the substrate in Caco-2 cells in a concentration-dependent manner with an IC50of 0.57 mg/mL. Furthermore, EEB could also attenuate glucose transport in Caco-2 cells, which could be decreased to 26.25% by EEB (1 mg/mL). These results indicate that EEB exerts strong anti-hyperglycemic effect by suppressing disaccharidase and glucose transportors. GC-MS analysis was conducted to elucidate the composition of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves. It was found that acids, monosaccharides, polyphenols, esters, amino acids were the main components of EEB. Further analysis by GC-MS revealed that the ethanol extract was rich in DL-isocitric acid lactone, thymol, catechin, 2,6-dihydroxybenzoic acid and 3,4-dihydroxy cinnamic acid. These compounds may play important roles in the hypoglycemic effect of the extract. The present study suggests Eucommia ulmoides leaves are a medicinal food material for preventing and treating diabetes, and could be further developed into healthful products.

Eucommia ulmoides leaves; Caco-2 cells; α-glucosidase; hypoglycemic; glucose transport; catechin

TS252.1

A

1002-6630（2014）17-0197-07

10.7506/spkx1002-6630-201417038

2013-11-03

国家自然科学基金面上项目（J1103516）

张红霞（1988—），女，硕士研究生，研究方向为功能性食品。E-mail：Luludeer0305@sina.cn

*通信作者：范俊峰（1970—），男，副教授，博士，研究方向为植源性多肽和黄酮的抗血栓、抗糖尿病功能。

E-mail：fanjunfeng@bjfu.edu.cn