申福国 孔维丽 刘士臣 崔绪民 崔宏宇 赵中南 张富运 宋春雨 杨建华

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.011

基金项目：黑龙江省自然基金（D201160）;黑龙江省教育基金（12511539）

作者单位：154002黑龙江省佳木斯，佳木斯大学第一附属医院骨科（申福国、刘士臣、崔宏宇、赵中南、张富运、宋春雨、杨建华），内分泌科（孔维丽）;鹤北林业局医院外科（崔绪民）

通信作者：杨建华，Email： jianhua01@163.com

【摘要】目的探讨同种异体骨髓单个核细胞（BMMNCs）移植对脊髓全横断损伤区局部微环境中巢蛋白和突触素Ⅰ表达的影响及意义。方法120只清洁级Winstar大鼠（雌雄不拘）随机（随机数字法）取87只分为3组。假手术组29只：切除相应的椎板不损伤脊髓;模型组29只：建立脊髓全横断模型;细胞移植组29只：建立脊髓全横断模型后，给予BMMNCs移植治疗。各组大鼠分别于5 d、1周、2周、4周利用免疫组织化学技术、RT-PCR检测脊髓组织中巢蛋白（nestin）与突触素Ⅰ（Synapsin I）的表达变化及利用MIAS-2000图像处理系统分析观察 nestin 和Synapsin I阳性产物在脊髓的分布，并测量阳性产物的吸光度值。采用SPSS 17.0统计分析数据，组间比较， 方差齐者采用完全随机设计资料的方差分析，样本间的两两比较用q检验;方差不齐者用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法），样本间两两比较的秩和检验（Nemenyi法）;P<0.05为差异具有统计学意义。结果免疫组织染色、RT-PCR及图像处理系统分析结果显示模型对照组在伤后约5 d可见损伤区域附近nestin表达升高，2周达高峰，4周后 nestin表达明显下调，细胞移植组在脊髓伤5 d可见损伤区域附近nestin表达升高，1周达高峰，4周后 nestin表达明显下调，且各时期与假手术组、模型组相比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。损伤5 d后，在损伤区域出现突触素Ⅰ的表达，但模型组、细胞移植组突触素Ⅰ的表达量在各时间点均低于假手术组，细胞移植组高于模型组（P<0.01）。结论同种异体的骨髓单个核细胞移植可能改变了局部的微环境并上调了脊髓内巢蛋白和突触素Ⅰ的表达。

【关键词】骨髓单个核细胞;脊髓全横断损伤;细胞移植;巢蛋白;突触素I ;脊髓损伤;免疫组化;反转录酶-聚合酶链锁反应

Effect on the expression of nestin and synapsin I after spinal cord injury in rats

Shen Fuguo*，Kong Weili，Liu Shichen，Cui Xumin，Cui Hongyu，Zhao Zhongnan，Zhang Fuyun，Song Chunyu，Yang Jianhuan，*Department of Orthopedics Surgery， First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002， China

Corresponding author： Yang Jianhua， Email： jianhua01@163.com

【Abstract】Objective To investigate the effects and significance of site transplantation of allogenic bone marrow mononuclear cells （BMMNCs） on the expression of nestin and synapsin I in the local microenvironment of transected injury zone in spinal cord.Methods From a pool of 120 clean grade Wistar rats （Irrespective of gender）， 87 rats were randomly （random number） selected and subdivided into three groups. Sham operation group （n= 29） had laminectomy done without inducing spinal cord injury. The model control group （n= 29） had laminectomy done followed by induction of complete spinal cord transected injury. Cell transplantation group （n= 29） had BMMNCs transplantation initiated after induction of complete spinal cord transected injury. Nestin and Synapsin expressions in all rats of each group were assessed on day 5， week 1， week 2 and week 4， respectively by using immunohistochemical and RT-PCR techniques. Spread of Nestin positive and Synapsin I positive products along the spinal cord were assessed by use of MIAS-2000 image processing system analysis. Optical density of these products was then measured. Statistical data analysis was done using SPSS17.0. Uniform variance analysis was done for inter group comparison using completely random design data， while paired sample comparison done with the Q test. For non-uniform variance， multiple samples were compared using design rank sum test with Kruskal-Wallis method， whereas paired samples rank sum test with Nemenyi method. P value of P<0.05 was regarded statistically significant， and P<0.01 regarded highly statistically significant. Results  Immunohistochemistry， RT-PCR and image processing system analysis showed model control group had increased nestin expression within the damaged zone 5 days after injury， reaching peak level at 2 weeks then significantly down regulated 4 weeks later. In cell transplantation group， nestin expression around spinal cord injury zone increased 5 days after injury and reached the peak level at 1 week， then subsequently significantly down regulated 4 weeks later. At each interval， there were significantly statistical differences between sham surgery group and model control group and cell transplantation group （P<0.05）. Synapsin I expression appeared within the damaged area 5 days after injury， but at each interval， the expression of synapsin I in the model control group and cell transplantation group was lower than that in sham operation group. However， synapsin I in cell transplantation group was higher than that in model control group （P< 0.01）. ConclusionsAllogenic bone marrow mononuclear cells transplantation may alter the local microenvironment and up-regulate the expression of nestin and synapsin I in the spinal cord injury model.

【Key words】Bone marrow mononuclear cells; Spinal cord injury; Cell transplantation; Nestin; Synaptophysin I; Spinal cord injury; Immunohistochemistry; RT-PCR

脊髓损伤（ spinal cord injury ，SCI） 是目前发病较高，而在中国SCI患者将近有1百万人^[1]，脊髓功能的恢复仍是目前面临的难题，然而动物实验已经证实移植的骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells， BMMNCs）对脊髓损伤的治疗取得了可观的效果^[2]。巢蛋白（nestin）是神经干细胞上的一种特异性分子标记物，它的表达活性能直接反映脊髓神经细胞的分化及发育状况，是研究脊髓神经干细胞增殖、分化、迁移规律的特异指标^[3]。突触素I （Synapsin I）主要是于突触前膜有关的蛋白之一，它在神经递质释放过程中发挥了重要的作用，它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关^[4]。Synapsin I可影响大鼠突触细胞的形成和轴突的延长，Synapsin I缺乏的大鼠突触细胞形成减少，轴突的再生及延长也显著减少^[5]。本实验通过BMMNCs移植脊髓全横断模型大鼠，观察对大鼠后肢功能及受损脊髓组织中巢蛋白和突触蛋白表达的影响，探讨脊髓损伤后的微环境中nestin和Synapsin I表达变化是否为脊髓功能恢复的机制之一。

1材料与方法

1.1实验动物及其分组

取120只8 周龄Winstar，雌雄不拘，体质量（200±20）g，清洁级（由佳木斯大学动物中心提供）。随机（随机数字法）87只分为 ：细胞移植组、假手术组、 模型组，每组各29只。实验中对动物的处置符合我国相关伦理学规定^[6]。动物在（23±2）℃饲养室饲养。

1.2主要试剂及仪器

试剂：兔抗鼠nestin多克隆抗体、兔抗鼠突触素I多克隆抗体 。SABC试剂盒（武汉博士德）、DAB试剂盒（大连宝生物工程公司），RNAiso Plus、RT-PCR试剂盒（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），淋巴细胞分离液（生物制品科技有限责任公司）

仪器：切片机、显微镜（德国Leica）。

1.3SCI动物模型制备、骨髓单个核细胞提取和移植

1.3.1SCI动物模型制备 将Winstar大鼠称重并取右腹股沟中点上方 约0.5 cm处进针，用氯胺酮 （ 50 mg / kg ） + 安定 （ 2.5 mg / kg ）混合液腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧固定、 备皮、 消毒。以T9锥体棘突为中心，上下纵行切开约 1.5 cm，逐层分离直到暴露椎板和椎体棘突，用微型枪钳咬除 T8～T10椎板至两侧关节突内缘。用微型神经剥离子纵行剖开硬脊膜约0.5 cm，用自制超薄刀片完全横断脊髓。用PBS液多次冲洗后逐层缝合切口。术后连续3 d每日一次给予青霉素（3万U/kg）腹腔注射预防感染一次，早晚人工排便各一次。造模成功后因感染等因素脱失1只。

1.3.2骨髓单个核细胞提取在无菌操作条件下切取Winstar大鼠的双下肢股胫骨，用2 mL无菌生理盐水反复冲洗骨髓腔，用低温离心机离心1次（1500 r/min、5 min、4 ℃）弃上清液。在低温条件下用Ficoll密度梯度离心法^[7]分离骨髓单个核细胞。借助光学显微镜下计数器记数细胞个数，检测其细胞活性约为95%后再加PBS缓冲液制成BMMNCs悬液（要求细胞含量为6×1011 L-1），配置细胞悬液放置在4 ℃冰箱内保存。

1.3.3骨髓单个核细胞移植

细胞移植组于椎管内脊髓损伤区上下两端分别注射15 μL含量为6×1011 L-1的骨髓单个核细胞悬液;假手术组只咬除 T8～T10椎板至两侧关节突内缘不损伤脊髓，逐层缝合;模型对照组按细胞移植组的方法分别注射15 μL PBS缓冲液。

1.4免疫组织化学技术检测及阳性细胞计数和平均吸光度值检测

1.4.1切片常规脱蜡水化3% H₂O处理，微波修复抗原，分别滴加一抗：兔抗鼠nestin多克隆抗体和兔抗鼠突触素I多克隆抗体，4 ℃过夜后分别滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，加SABC工作液，DAB显色，苏木素染色，封片观察。

1.4.2采用MIAS-2000图像分析系统进行观察分析观察 nestin 和突触素Ⅰ阳性产物在脊髓的分布， 分别计数各组术后第 5天、第1周及第2周和4周脊髓内中外三个视野 1028 μm2面积内的阳性细胞数，并测量阳性产物的吸光度值。

1.5RT-PCR检测

引物设计由生工生物工程上海有限公司合成。见表1。

在各实验动物到达存活时间点后，处死取脊髓组织标本，取损伤处上下各约5 mm脊髓。首先，分别严格按照RNAiso Plus、RNA PCR试剂盒说明书来提取总RNA;其次，取其浓度用紫外分光光度仪测量;再次，按照RT-PCR 试剂盒说明书合成cDNA ，起始总RNA样品均取2 g严格按照反应条件行RT-PCR反应。以GAPDH内参的拷贝数的比值进行数据统计。引物及内参基本信息（见表1）。

1.6统计学方法

数据采用SPSS 17.0统计分析，①统计描述用均数±标准差（x±s）表示，②组间比较， 方差齐者采用完全随机设计资料的方差分析，3个样本间的两两比较用q检验;方差不齐者用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法）， 3个样本间两两比较的秩和检验（Nemenyi法）;以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1免疫组织化学技术检测结果

巢蛋白在各组大鼠脊髓内的神经元均可见阳性产物的表达，且其定位于细胞浆内。（见图1A、B、C）。各实验点的细胞移植组和假手术组较模型组的阳性细胞数及平均吸光度值均增加，且差异具有统计学意义 （ P< 0.05 ），细胞移植组较假手术组增加明显，差异具有统计学意义（P<0.05），具体数值详见表 2、3。

突触素Ⅰ蛋白在各组脊髓神经元细胞浆内均可见细胞浆内阳性产物。见图1D、E、F。且不同时间点假手术组阳性细胞数与细胞移植组、模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）;不同时间点检测显示细胞移植组阳性细胞数和平均吸光度值与模型组相比较明显较多（P<0.05），这说明细胞移植组各时间点Synapsin I表达量均高于模型组。细胞移植组与假手术组相比较，各时间点阳性细胞数和平均吸光度值较小（P<0.05），这说明细胞移植组Synapsin I表达量于不同时间点均低于假手术组，具体数值详见表4、5。

表2结果显示，在5 d、1周、4周时间点，脊髓内巢蛋白阳性细胞数比较，细胞移植组高于模型组，高于假手术组，且两两比较差别均有统计学意义（P<0.05）;在2周时，细胞移植组高于假手术组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1A、B、C。

表3结果显示，各时间点，脊髓内巢蛋白阳性细胞数比较，细胞移植组高于假手术组，且差异具有统计学意义（P<0.05）; 在4周时，细胞移植组高于模型组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1A、B、C。

表4结果显示，各时间点， 脊髓内突触素I蛋白阳性细胞数比较，细胞移植组高于模型对照组，低于假手术组，且两两组间比较差别均有统计学意义（P<0.05）。见图1D、E、F。

表5结果显示，各时间点， 脊髓内突触素I蛋白阳性细胞平均吸光度比较，细胞移植组高于模型组，低于假手术组，且两两组间比较差别均有统计学意义（P<0.05）。见图1D、E、F。

2.2RT-PCR检测结果

巢蛋白RT-PCR结果见图2A，从表6中相对吸光度比值分析可见：在不同时间点受损的大鼠脊髓组织中nestin mRNA表达量细胞移植组与假手术组、模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）;且在各时间点细胞移植组的脊髓组织中nestin mRNA表达量与模型组比较明显较高，差异具有统计学意义（P<0.05）。

突触素I RT-PCR结果见图2B，从表7中OD相对比值分析可见：假手术组大鼠脊髓内可见少量Synapsin I mRNA的表达，假手术组大鼠脊髓内Synapsin I mRNA的表达水平显著高于模型组（P<0.01），细胞移植组Synapsin I mRNA表达水平显著高于假手术组，差异具有统计学意义（P<0.05），详见表7。

表6结果显示，各时间点， Nestin（吸光度值）/GAPDH（吸光度值）比较，细胞移植组高于模型组，高于假手术组;且组间两两比较差别均有统计学意义（P<0.01）。见图2A。

表7结果显示，在5 d、1周、4周时间点， Synapsin I（吸光度值）/GAPDH（吸光度值）比较，细胞移植组高于模型组，但低于假手术组;然而组间两两比较差别均有统计学意义（P<0.01）; 在2周时，细胞移植组高于模型组，且差别均有统计学意义（P<0.05）;见图2B。

3讨论

 近年来有关干细胞移植治疗中枢神经系统损伤后再生修复的研究一直是神经-生物科学领域的热点。采用干细胞移植的方法来治疗急性脊髓损伤修复的研究受到了基础和临床科研工作者的青睐。许多动物实验研究均已经证实胚胎干细胞^[8]、血管内皮祖细胞^[9]和骨髓单个核细胞^[10]等细胞能对脊髓损伤有一定的修复作用。研究证明骨髓单个核细胞移植到损伤的脊髓后能可以在宿主脊髓中存活、发育、迁移和分化为新生的血管和神经元并分泌神经营养物质和形成神经连接，促进神经组织的修复，改善其神经功能^[11-12]。但其治疗机制仍不十分清楚。

 本实验通过骨髓单个核细胞移植并观察脊髓损伤区附近nestin和SynapsinⅠ的表达，通过免疫组织化学技术及RT-PCR结果均表明受损伤大鼠脊髓的神经功能恢复与nestin、SynapsinⅠ表达有一定的相关性。

研究表明，nestin是一种中间丝蛋白，可作为神经干细胞的免疫标志物，只在多潜能的神经外胚层细胞中表达，随着神经上皮的分化、成熟而逐渐消失，但在少数保持神经发生功能的部位，nestin仍有表达，如大脑室管膜下区、脊髓中央管室管膜层也存在着大量未分化细胞^[13]。本实验观察到，在免疫组化技术nestin的阳性反应物主要存在于胞浆中，细胞核也有阳性反应物存在，其镜下免疫染色呈棕褐色或棕色。假手术组的脊髓内nestin很少表达，模型组的脊髓损伤后使得巢蛋白表达增强，细胞移植组较模型组表达更强，差异具有统计学意义（P<0.05）。从各时间点上看到，细胞移植组与假手术组相比：术后5 d、1周、2周，各点巢蛋白表达均较多，差异具有统计学意义（P<0.05），且1周时表达量较2周时高，以后逐渐减少，4周时表达量较假手术组少，这可能与SCI后期神经元细胞的变性、死亡或移植的细胞量减少等有关。这与李俊岑等^[14]的研究结果相似，他们研究发现大鼠在脊髓损伤后在伤后第24 h，nestin阳性表达开始出现，伤后第5天达高峰、2 周呈下降趋势， 还提示脊髓内神经细胞的增殖活性与脊髓损伤的类型、严重程度和损伤的时间长短呈负相关。因此，nestin作为神经干细胞的免疫细胞标志物，其表达量的多少和峰值是否提前均可提示神经细胞的增殖情况。在RT-PCR结果显示细胞移植组nestin mRNA的表达量明显高于模型组。以上实验结果均提示BMMNCs可改善SCI大鼠后肢运动功能的恢复且可能与脊髓内nestin mRNA的表达上调有关。以上实验结果均提示BMMNCs能够使脊髓内nestin mRNA的表达上调，可能改善局部损伤的微环境，防止脊髓的继发性损伤有关。

另外，研究证实突触素I是存在突触囊泡膜上的一种特异性蛋白质，在神经递质的释放、转运、信息传递和神经元突触的发生及可塑性的过程中发挥着至关重要的作用，SynapsinⅠ其免疫阳性产物主要存在于脊髓灰质内且免疫染色呈棕褐色或棕色，常见于神经细胞突起，呈点状、颗粒状分布。本实验研究发现，细胞移植组与假手术组SynapsinⅠ的表达量逐渐增多，且于术后3 周时达高峰;细胞移植组和模型组相比可见各观察点的SynapsinⅠ表达较少，且差异具有统计学意义（P<0.05），这可能是脊髓在创伤后神经元细胞和轴突的变性、坏死、退变、凋亡等致SynapsinⅠ来源减少有一定相关性^[15]。从免疫组化技术及RT-PCR检测均可表明，BMMNCs移植后可使受损的脊髓组织内SynapsinⅠ mRNA的表达上调。这与Akiyama等^[16]研究相似，更证明了骨髓单个核细胞移植增加了中枢和外周髓鞘上轴突间的传导速度和蛋白表达，且均改善了实验大鼠后肢神经功能。实验表明Synapsin I在正常大鼠脊髓组织和受损伤脊髓组织中均有一定表达，且受损伤脊髓组织中表达量低于正常脊髓组织，细胞移植组Synapsin ImRNA表达量均高于模型组、低于假手术组，提示BMMNCs通过上调神经元内突触素I表达，可能促进了神经元细胞轴突的再生和调控了突触的形成、可塑性。

目前在动物实验中骨髓单个核细胞移植治疗SCI已经取得了一定的疗效^[17-20]，但移植的骨髓单个核细胞在受损的脊髓内存活、分化及增殖的具体机制尚不明确。根据本实验研究结果， SCI损伤处附近的nestin和SynapsinⅠ表达的明显增高，这可能是移植的骨髓单个核细胞改变了脊髓横断处局部的微环境，这种改变有利于神经干细胞或前体细胞的激活与生存有利于防止脊髓的继发性损伤。所以SCI恢复的过程是多因素共同作用的结果，受损脊髓组织中nestin和Synapsin I的表达上调可能是BMMNCs改善SCI大鼠脊髓功能的机制之一。

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（收稿日期：2014-06-19）

（本文编辑：何小军）

p1348-1354