陆如凤 黄小民 吴海波 张卓一 丁黎敏 吴丽娟 徐俪颖

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.010

基金项目：浙江省中医药科学研究基金项目（2012ZB039，2013ZA056）;浙江省医药卫生科学研究基金项目（2013KYA141）

作者单位：310006 杭州，浙江中医药大学附属第一医院急诊科（陆如凤，黄小民，张卓一，丁黎敏，吴丽娟，徐俪颖）;浙江省医学科学院生物工程所（吴海波）

通信作者：黄小民，Email： Mxh251770@aliyun.com

【摘要】目的观察急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺组织中Toll样受体4（TLR4）和核因子-κB（NF-κB） mRNA表达的变化，探讨TLR4-NF-κB通路在急性PQ中毒肺损伤中的作用。方法30只雄性SD大鼠随机分为2组：生理盐水（NS）对照组（6只，NS腹腔注射），PQ染毒组（24只，腹腔注射PQ溶液，20 mg/kg）。PQ染毒组分别在染毒后6、24、48 h及72 h麻醉处死， NS对照组于处理后6 h处死，进行肺组织HE染色，病理学观察，用实时定量PCR方法检测TLR4和NF-κB的mRNA表达情况，用ELISA方法测定肺组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清中IL-6含量。结果PQ染毒组大鼠肺组织病理表现为早期充血水肿明显，大量炎性细胞浸润。与NS对照组相比PQ染毒组肺组织中TLR4和NF-κB mRNA的表达量、TNF-α、IL-6含量在各时间点均有不同程度升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）。结论大鼠急性PQ中毒后肺组织中TLR4和NF-κBmRNA表达量、TNF-α、IL-6含量明显上调，TLR4-NF-κB通路参与了PQ中毒大鼠肺损伤的早期病理生理过程。

【关键词】百草枯;急性肺损伤;大鼠;肺组织;Toll样受体4;核因子-κB;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6

Expressions of toll-like receptor 4 mRNA and nuclear factor-κB mRNA in lung tissue of rats with acute paraquat poisoning

Lu Rufeng， Huang Xiaomin， Wu Haibo， Zhang Zhuoyi， Ding Limin，Wu Lijuan，Xu Liying. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310006，China

Corresponding author： Huang Xiaomin， Email： Mxh251770@ aliyun.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expressions of toll-like receptor 4 mRNA and nuclear factor-κB （TLR4-NF-κB） mRNA in lung tissue of rats with acute paraquat poisoning. MethodsThirty male SD rats were randomly divided into two groups， namely normal saline group （NS group， n=6） and the PQ groups （n=24）. The rats of PQ group were administered with 20 mg/kg PQ by intraperitoneal injection to establish the models of PQ induced lung injury. The saline was administered once instead in normal saline group. The rats of PQ group were sacrificed separately at 6 h，12 h，24 h，48 h and 72 hours after modeling， while at 6 hours the rats of normal saline group was sacrificed.The expressions of TLR4 mRNA， NF-κB mRNA，and the levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in lung （serum） of rats were detected.Meanwhile， pathological changes of the lung tissue were examined under optical microscope.Results There were no histopathological changes such as alveolar edema，hemorrhage and inflammatory cell infiltration found in NS group other than in PQ group. At the 72 h， the expressions of TLR4 mRNA （9.61±0.21），NF-κB mRNA （5.62±0.24）， and the levels of TNF-α（153.08±5.02） pg/ml， and interleukin-6 （230.08±10.64） pg/mL in lung tissue of rats were significantly higher in PQ group than those in control group （P<0.01）. ConclusionsIn rats after PQ poisoning， the expressions of TLR4 mRNA， NF-κB mRNA， and the levels of TNF-αand IL-6 were higher than those in normal rats， and the TLR4-NF-κB pathway could play an important role in lung injury of rats with PQ poisoning.

【Key words】Paraquat;Acute lung injury;Rat;Lung tissue;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-κB;Tumor necrosis factor-α;Interleukin-6

百草枯（paraquat，PQ）是一种非选择性、接触性除草剂，在世界范围内广泛使用。目前PQ中毒无特效解毒药，常规对症处理效果极差，口服病死率高达60%以上^[1-3]。PQ中毒特征性改变是急性肺损伤（acute lung injury，ALI），主要是由于肺泡I型和Ⅱ型上皮细胞早期的破坏和肺泡炎、肺水肿、炎症细胞浸润导致的，并最终引起肺纤维化^[2，4]。PQ引起的ALI和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是PQ中毒致死的主要原因，而相关机制尚不完全清楚。近年研究结果显示TLR4、NF-κB参与了脂多糖和病毒感染所致小鼠肺损伤的过程，并能释放大量炎症因子，引起脏器损伤^[5-6]。本研究通过腹腔注射PQ的方法，建立大鼠急性PQ中毒肺损伤模型，观察大鼠急性PQ中毒后肺组织中TLR4和NF-κBmRNA及炎症因子表达的变化，对PQ中毒ALI作用机制做了初步探讨。

1材料与方法

1.1材料及试剂

健康雄性SD大鼠体质量200～220 g，清洁级，由浙江省实验动物中心提供并在清洁级环境下饲养（许可证：SCXK（浙）2008-0033号）。PQ为青岛瀚生生物科技股份有限公司产品（20110210057），TNF-α ELISA试剂盒为NeoBioscience产品（R120822-12a），IL-6 ELISA试剂盒为NeoBioscience产品（R120822-06a）。TRIzol试剂为美国Invitrogen产品，逆转录试剂盒为大连宝生物产品，SYBR Green实时定量PCR试剂为北京康为世纪产品。全自动石蜡切片机为德国Leica产品，光学显微镜为日本Olympus产品，酶标检测仪为美国BioRad产品，荧光定量PCR仪美国Corbett Research产品。

1.2动物分组及模型建立

将30只SD大鼠随机（随机数字法）分为生理盐水（NS）对照组和PQ染毒组，NS对照组6只，给予1 mL NS腹腔注射。PQ染毒组24只，予PQ溶液20 mg/kg，用NS稀释至1 mL，一次性腹腔注射染毒，建立大鼠PQ中毒模型。

1.3标本采集与检测

NS对照组于处理后6 h，PQ染毒组于染毒后6、24、48、72 h各取6只，用25%乌拉坦溶液麻醉，股动脉取血处死大鼠。处死后开胸取肺组织，取左肺相同部分固定于10%甲醛液内，经石蜡包埋、切片和HE染色，观察组织学变化。常规分离获得血清，对IL-6含量进行测定，按试剂盒说明书进行操作。对肺组织中TNF-α、TLR4-NF-κB mRNA表达水平测定，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行检测，按试剂盒说明书进行操作，引物序列及反应条件见表1。

1.4统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS统计软件17.0进行分析。各组间数据比较采用One-way ANOVA，两两比较用最小的显著差异法分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1大鼠急性PQ中毒临床表现

PQ染毒组大鼠在染毒后2 h开始出现精神不佳，出现不同程度的毛发松散、眯眼、拱背、步态蹒跚，12 h后则出现口唇发绀、后肢无力、仰卧，并伴有呼吸加深加快等现象，24h时出现反应迟钝、呼吸急促甚至呼吸窘迫等各种症状，部分大鼠出现血尿、眼球出血等现象。

2.2肺组织TLR4和NF-κB mRNA及炎症因子表达

大鼠染毒后肺组织中的TLR4表达量发生了改变，染毒第6 h后，TLR4基因mRNA表达量提高到6.8倍以上，并且随时间改变而增加，第48小时达到最高，为12.82倍，之后开始下降。大鼠染毒后肺组织中NF-κB表达量发生了改变，也随着时间的增加而增加，48 h后为最高，提高到6.99倍，之后开始下降。因此，总体上，大鼠染毒后肺组织TLR4和NF-κB表达量的改变趋势基本一致，都随着时间的延长而提高，在第48 h达到最高值，之后逐渐下降。与NS对照组相比较，PQ染毒组的肺组织匀浆中TNF-α含量有显著增加（P<0.01），并且随着时间延长而不断提高;PQ染毒组大鼠血清中的IL-6含量有显著增加（P<0.01），也随着时间延长而不断提高，见表2。

2.3急性PQ中毒大鼠肺组织病理改变

NS对照组解剖见肺组织呈均匀粉红色，胸腔无渗出液，在普通光学显微镜下，可见NS对照组的肺组织结构正常，肺泡结构清晰，肺泡腔及支气管腔内未见明显的炎细胞及渗出物，可见少量红细胞。PQ染毒组大鼠肺脏组织外观具有明显的水肿，充血，在水中能够沉入水底;在普通光学显微镜下，切片观察可见肺组织发生水肿，部分有透明膜形成，严重时出现弥漫性肺出血，肺泡腔塌陷萎缩和变窄，甚至结构消失，肺泡间隔明显增厚，随时间的延长肺组织损伤程度加重，见图1。

3讨论

PQ中毒后可造成全身多器官损伤，其中以肺损伤最为严重，表现为早期肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，炎症细胞浸润，继而发生I型呼吸衰竭，晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化。近年研究发现，炎症反应参与了PQ中毒肺损伤，PQ中毒后大量前炎因子启动炎症反应，其中TNF-α和IL-6与ALI/ARDS关系最为密切^[7]。TNF-α在炎症反应中具有始动和关键的促炎免疫作用，临床研究表明，急性PQ中毒后多器官功能障碍综合征患者血清TNF-α含量较正常组明显升高^[8]。胡军利等实验结果显示，PQ中毒大鼠血清中TNF-α含量在1～3 d具有很高的表达水平，与正常组对比差异具有统计学意义^[9]。在本研究中，PQ染毒组肺组织匀浆中TNF-α含量有显著增加，并随着时间延长而不断提高，在所观察的72 h内，第72 h为最高值并且。IL-6是急性肺损伤和肺纤维化中主要的炎症细胞因子之一，在调节免疫反应、急性期反应和血细胞生成，并在宿主防御机制中起到关键作用。在临床的相关观察中也发现急性PQ中毒后ARDS患者血清IL-6含量与正常人相比较也具有明显升高^[10]，在实验染毒大鼠血清中的IL-6含量随时间延长而逐渐升高，并在第3d达到峰值^[11]。本研究结果表明，PQ染毒组大鼠血清中IL-6含量有显著增加，并随着时间延长而不断提高，在所观察的72 h内，第72 h为最高值。

全身炎症反应综合征是PQ中毒的常见并发症，是通向多器官功能障碍综合征的转折点，而核因子-κB（NF-κB）是核内炎性递质基因转录的开关^[12-13]。活化后的NF-κB可诱发TNF-α、IL-6、IL-8及继发性炎症因子形成“细胞因子级联反应”启动肺部炎症^[14]。PQ中毒后肺组织中TNF-α水平有所增高，TNF-α可以触发白细胞三烯和前列腺素E2的合成，然后刺激中性粒细胞对肺脏的浸润，从而引起肺损伤^[15]。相关研究表明，TLR4—NF-κB通路的激活能够增强TNF-α、IL-6等众多细胞因子的转录，诱导感染细胞分泌炎症因子和I型干扰素，启动免疫应答^[5-6]。先前研究表明，大鼠在PQ中毒诱导的肺损伤过程中，1～14 d中的肺组织NF-κB活性均明显升高，活性值在3 d为最高点，为正常的6.59和8.35倍^[9，12]。在本研究中，染毒组中由PQ中毒所致大鼠急性肺损伤的肺组织中TLR4表达量改变也较为明显，与NS对照组具有显著提高，提示TLR4对百草枯这种化合物具有一定的识别作用。而同时，在急性PQ中毒大鼠肺组织内，NF-κB表达量具有明显增加，在48 h达到最高值，之后也保持了较高水平，这与先前的研究结果基本一致。

本研究结果显示，大鼠急性PQ染毒后出现明显的呼吸困难等急性肺损伤表现，肺组织病理显示肺组织大量炎性细胞浸润，伴充血水肿。大鼠肺组织病理改变趋势与肺组织中TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α和IL-6的变化趋势基本一致。综上所述，大鼠急性PQ中毒后肺组织中TLR4、NF-κB mRNA、TNF-α和IL-6的表达明显上调，表明TLR4—NF-κB通路参与了PQ中毒大鼠ALI的早期病理生理过程。通过阻断TLR4—NF-κB的激活，将有助于抑制PQ中毒患者病情的发生与发展。

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（收稿日期：2014-07-19）

（本文编辑：何小军）

p1344-1347