张永帅，孙俊良，梁新红，李元召

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

荧光标记法测定菌落总数

张永帅，孙俊良*，梁新红，李元召

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

采用一种新型破膜剂麝香草酚将微生物细胞壁完全破裂，再用碘化丙啶荧光标记微生物核酸或DNA，测定荧光值。建立工作曲线，根据荧光值在工作曲线上查出菌落总数。结果表明，破膜剂麝香草酚的最适浓度为4 mmol/L，本方法测定枯草芽孢杆菌菌落数对应荧光值的相对标准偏差为1.29%，回收率为98.4%。方法准确可靠，而且不需要大量铺平板，简便快速。

荧光标记；菌落总数；麝香草酚

食品安全全球关注，已成为继人口、资源、环境之后第四大社会问题。食品中有害污染物，包括物理、化学、生物性污染物等，严重危及人类健康、生命安全，微生物污染造成食源性疾病仍是世界食品安全中最突出问题[1]。对食品中病原菌、腐败菌或指示菌可通过各种方法进行检测。传统的细菌培养法仍是标准，因为液体肉汤和固体琼脂培养基中靶细菌的存在及计数是其增殖能力的有力证据[2]。

GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》规定两种测定方法，第1法为平板菌落计数法；第2法为菌落总数PetrifilmTM测试片法。平板菌落计数法要求严格，需要一定专业操作技能,操作复杂且工作量大。相比GB/T 4789.2—2003《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》，GB/T 4789.2—2008增加第2法（菌落总数Petrifi lmTM测试片法）。与第1法比较，第2法省去配制培养基、消毒和培养器皿清洗消毒、实验废弃物灭菌处置等大量辅助性工作，劳动强度减轻、材料成本降低、操作程序简化。两种测试法中规定：一般食品（36±1）℃培养（48±2）h，水产品（30±1）℃培养（72±3）h[3]。但在实际情况中，有些食品如面包、蛋糕保存期仅两三天，有些食品如馒头、米饭等是当天生产当天销售完，基本没有库存，实时采集样品，采用国家标准测定方法获得检测结果意义有限。由此，快速检测技术应运而生，并由培养水平向分子水平迈进；特别 是近年随分子生物学、微电子技术及生物技术发展，微生物快速检验技术已有很大发展。

近几年，生物电化学方法、阻抗法、伏安分析法、电位电流分析法等快速检测技术已经得到发展，而且新的技术也在不断产生[4-18]。有研究[19-20]表明腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）生物发光法是利用产生于生物体内化学发光现象建立的一种检测方法，即在一个反应系统中，当虫光素酶和虫荧光素处于过量情况下，荧光强弱取决于ATP数量。因此，在检测含细菌样品时，细菌细胞越多，ATP量越高，发出荧光也就越强。由于虫光素酶对ATP反应非常灵敏，荧光强弱可通过荧光仪计量。所以，在排除样品中非细菌ATP干扰情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP量，通过相对荧光值和细菌细胞数关系曲线，就能快速确定样品中细菌细胞数[21]。本实验采用碘化丙啶荧光标记DNA或核酸，通过测荧光值确定菌落总数，方法快速、可靠。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

枯草芽孢杆菌168、酵母菌和黄曲霉菌 中国工业微生物菌种管理保藏中心；20 g/100 mL十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfat，SDS）溶液；20 g/100 mL Triton溶液；20 mmol/L麝香草酚溶液；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）和GoldView宝生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

VariosKan Flash型多功能酶标仪 美国赛默飞世尔公司；SW-CJ-1D单人单面垂直送风（经济型）净化工作台 中国苏州智净净化有限公司；ZHWI-Z11C恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司；SHP型生化培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海中安医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 破膜剂的选择

在96 孔板A04～A12中分别加入100 μL菌液，在A04～A06中分别加入10、50、100 μL 20 g/100 mL SDS溶液，在A07～A09中分别加入10、50、100 μL 20 g/100 mL Triton溶液，在A10～A12中分别加入10、20、40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，这9 个孔中不足200 μL的用无菌水补充到200 μL。用VariosKan Flash型多功能酶标仪在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值。

在以上基础上，在A04～A12中分别加入0.2 μL 2 mg/mL PI，在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值。根据荧光值分析破膜剂的破膜效果，选择合适的破膜剂。

1.2.2 麝香草酚最佳破膜浓度选择

在96 孔板G04～G10中分别加入100 μL菌液，在G04～G10中分别加入0.5、10、20、30、40、60、80 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，这7 个孔中不足200 μL的用无菌水补充到200 μL。然后每个孔再加0.2 μL 2 mg/mL PI，用VariosKan Flash型多功能酶标仪在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值。根据荧光值分析麝香草酚在不同浓度条件下的破膜效果，选择最佳的破膜浓度。

1.2.3 染色剂的选择

在96 孔板F01～F12中分别加入100 μL菌液，在F01～F12中分别加入40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，这12个孔中不足200 μL的用无菌水补充到200 μL。然后在F01～F04中分别加0.2 μL 2 mg/mL PI，在F05～F08中分别加0.2 μL 2 mg/mL EB，在F09～F12中分别加0.2 μL 2 mg/mL GoldView，F01～F04在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值，F05～F08在激发光为530 nm、发射光为590 nm波长处测定荧光值，F09～F12在激发光为280 nm、发射光为535 nm波长处测定荧光值。根据3 种染色剂的相对标准偏差来选择最优的染色剂。

1.2.4 工作曲线的制作

1.2.4.1 用测定某一菌液菌落数

采用平板菌落计数法，具体操作参照GB/T 4789.2—2008。

1.2.4.2 标准系列的配制

将1.2.4.1节所测菌液用无菌水10 倍稀释，稀释好的5 个菌液编号为1、2、3、4、5。

1.2.4.3 工作曲线的绘制

在96 孔板A01～A05中分别加入编号为1～5号的菌液100 μL，在A01～A05中分别加入40 μL 20 mmol/L麝香草酚溶液，60 μL的用无菌水。然后每个孔再加0.2 μL 2 mg/mL PI，用VariosKan Flash型多功能酶标仪在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值，绘制菌落总数的工作曲线。

1.2.5 样品的测定

采用1.2.4.3节的方法进行测量样品，测量应重复3 次以上求出平均值，在工作曲线上求出菌落总数。

2 结果与分析

2.1 破膜剂的选择

表1 3 种破膜剂荧光值Table1 Fluorescence values of three membrane-breaking reagents

由表1可知，3 种染色剂自身荧光值最高的是Triton试剂，能达到0.020 5。由于3 种染色试剂自身荧光值都很小，均在误差范围之内，因此3 种染色剂自身荧光值均无影响。

由图1、2可知，SDS作为破膜剂时，质量浓度在10 g/100 mL时荧光值最大为45.06±1.32；Triton作为破 膜剂时，质量浓度在10 g/100 mL时荧光值最大为13.76±0.86；麝香草酚作为破膜剂时，在4 mmol/L时荧光值最大为62.49±0.84。相比对实验结果的影响，麝香草酚作为破膜剂效果更好。

图1 SDS/Triton对实验结果的影响Fig.1 Fluorescence values of SDS/Triton at various concentrations

图2 麝香草酚浓度对实验结果的影响Fig.2 Fluorescence values of thymol at various concentrations

2.2 麝香草酚最佳破膜浓度选择

图3 麝香草酚不同浓度条件下的荧光值Fig.3 Sel ection of optimal thymol concentration

由图3可知，麝香草酚作为破膜剂时，浓度从0.5～4 mmol/L时荧光值随着浓度的增大而增大，最大值达到62.34±1.8；在4 mmol/L以后荧光值趋于稳定，基本保持不变。由此可以说明麝香草酚浓度在4 mmol/L时破膜效果好。

2.3 染色剂的选择

表2 3 种染色剂实验结果Table2 Selection of optimal staining agent

由表2可知，PI作为染色剂时，在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值为62.04，相对标准偏差为0.08%；EB作为染色剂时，在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值为26.40，相对标准偏差为8.70%；GoldView作为染色剂时，在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定荧光值为124.83，相对标准偏差为2.23%，由此可知PI是本实验的最佳染色剂。

2.4 工作曲线的制作

2.4.1 用国标法测定某一菌液菌落总数

将菌液用无菌水稀释一定的梯度，涂布平板，培养查出菌落总数（GB/T 4789.2—2008测定方法：平板菌落计 数法）。测出菌落总数为2×1011CFU/mL。

2.4.2 标准系列的配制

以已知菌落数的菌液配制标准系列，见表3。

表3 菌液的标准系列Table3 A series of standard bacterial concentrations

2.4.3 工作曲线的绘制

由1.2.4.3节的方法绘制工作曲线，得到回归方程：y=6.778 5x－26.202（R2=0.999 2），线性相关性较好。

2.5 样品测定

用1.2.4.3节的方法，将样品稀释100 倍（OD值小于1）后，测出稀释样品B. subtilis 168的平均荧光值为19.278，查对标准曲线算出稀释样品B. subtilis 168 的菌落总数为1.03×107CFU /mL，则样品B. subtilis 168的菌落总数为1.03×109CFU/mL。

2.6 方法精密度

表4 精密度实验Table4 Precision of the method

由表4可知，用此方法测定样品B. subtilis 168菌落数对应荧光值的相对标准偏差为1.29%，方法精密度好。

2.7 回收率

表5 菌落总数的回收率实验（n=7）Table5 Recovery of total number of colonies (n=7)

向样品菌液中加入一定量的菌液，使样品中菌体总数增加一定值。在激发光为535 nm、发射光为617 nm波长处测定加标样品的荧光值，得相应的菌落数，结果见表5。实验重复7 次结果可知，菌体的平 均回收率为98.4%，即方法准确度较高。

2.8 酵母菌和黄曲霉菌菌落总数

利用荧光标记法（上述方法）和平板菌落计数法（GB/T 4789.2—2008）测定酵母菌和黄曲霉菌菌落总数，结果见表6。每个实验重复3 次，两种发法测出的结果进行比较，酵母菌菌落数的相对标准偏差为7.04%，黄曲霉菌菌落总数的相对标准偏差为1.78%，方法准确可靠。

表6 酵母菌和黄曲霉菌菌落总数测定结果Table6 Determination of the numbers of yeast and Aspergillus flfl avus colonies

3 结 论

本方法在测定大批量样品菌落总数时，经实际样品测量，结果令人满意。由于本实验方法在建立好工作曲线后，整个操作在20 min以内能够完成，且与国标法测量结果一致。荧光标记测菌落总数的方法相比传统方法相比，大大简化了操作过程，提高了分析效率，为菌落总数的测定提供了一种可靠实用的分析方法。

[1] 熊海燕. 菌落总数检测技术研究进展[J]. 粮食与油脂, 2010(4): 42-44.

[2] 王晓英. 固相细胞计数法: 一种快速检测单细胞细菌的食品微生物新检测方法[J]. 国外医学: 卫生学分册, 2003, 30(3): 183-186.

[3] GB/T 4789.2—2008 食品卫生微生物学检验: 菌落总数测定[S].

[4] 胡珂文, 王剑平, 盖铃, 等. 电化学方法在微生物快速检测中的应用[J].食品科学, 2007, 28(12): 526-530.

[5] 顾其芳, 王颖. 阻抗法快速检测食品中乳酸菌的计数、菌落总数的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2002, 12(6): 650-652.

[6] 郭光美, 王振川. 伏安法快速检测牛乳及乳制品中细菌污染[J]. 食品科技, 2006, 31(11): 219-221.

[7] 金声琅, 李玉娟, 殷涌光. 采用显微图像识别技术快速检测食品细菌总数[J]. 农业工程学报, 2008, 24(4): 177-180.

[8] 卢智远, 牛中奇, 刘启, 等. 一种微生物检测的生物电化学方法研究[J].传感技术学报, 2005, 18(3): 481-483.

[9] 易敏英, 李志勇. 电阻抗法快速检测鲜牛奶中细菌总数[J]. 中国乳品工业, 2001, 29(3): 30-31.

[10] 王宁, 刘宁. 流式细胞术快速检测生乳中细菌总数[J]. 食品工业科技, 2007, 28(9): 197-200.

[11] WILSON I G. Use of the IUL countermat automatic colony counter for spiral plated total viable counts[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(8): 3158-3160.

[12] 李慧珠, 关嵘. 用疏水滤膜技术快速检测饮料等食品中的细菌总数和大肠菌等细菌[J]. 现代商检科技, 1998, 8(4): 24-27.

[13] JORGENSEN J H, LEE J C, ALEXANDER G A, et al. Comparison of limulus assay, standard plate count, and total coliform count for microbiological assessment of renovated wastewater[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1979, 37(5): 928-931.

[14] 韩树波. 伏安型细菌总数生物传感器的研究与应用[J]. 化学通报, 2000(2): 49-51.

[15] CON A X, MERCURIA J. Swab and excised tissue sampling for total and nterobacteriaceae counts of fresh and surface-frozen broiler skin[J]. Poultry Science, 1976, 55: 240 5-2408.

[16] JACKSON R W, OSBORNE K. Multiregional evaluation of the simplate heterotrophic plate count method compared to the standard plate count agar pour plate method in water[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(1): 453-454.

[17] 徐斐, 刘莉萍. 量热法快速测定糕点、面包中细菌总数的实验研究[J].食品工业, 2007, 28(4): 55-57.

[18] MOUNTNEy G J, O'MALLEy J. Statistical evaluation of electronic and plate counts for estimating bacterial populations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1966, 14(6): 845-849.

[19] 伍季, 王燕. ATP生物发光法快速检测啤酒中的菌落总数[J]. 河南科学, 2006, 24(1): 63-65.

[20] 史帅. ATP 荧光法快检系统实现细菌总数的快速检测[J]. 食品安全导刊, 2008(3): 51-52.

[21] 马妮. ATP 发光技术快速检测食品中菌落总数[J]. 中国卫生工程学, 2008, 7(5): 296-297.

Determination of Total Number of Colonies by Fluorescence Labeling Method

ZHANG Yong-shuai, SUN Jun-liang*, LIANG Xin-hong, LI Yuan-zhao
(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

After complete disruption of the microbial cell wall with thymol, the nucleic acids or DNAs were labeled with propidium iodide for the detection of fluorescence values. A standard curve was established for extrapolating total number of colonies based on the fluorescence values. The results showed that the optimal thymol concentration for breaking the microbial cell wall was 4 mmol/L. The relative standard deviation of this method for the determination of the fluorescence of B. subtilis colonies was 1.29%, and the recovery rate was 98.4%. This method is accurate, reliable, simple and rapid without the use of a large amount of plates.

fluorescence labeling; the total number of colonies; thymol

TS235.9

A

1002-6630（2014）20-0131-04

10.7506/spkx1002-6630-201420026

2013-11-04

国家自然科学基金面上项目（311641/C200101）；河南省科技计划项目（122102110037）

张永帅（1987—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：zys3485@163.com

*通信作者：孙俊良（1964—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与酶制剂工程。E-mail：sjl338@163.com