施建兵，谢 晶，高志立，苏 辉，吴 艳，张馥郁

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

响应面法优化鲳鱼复合生物保鲜剂配方

施建兵，谢 晶*，高志立，苏 辉，吴 艳，张馥郁

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

为了保持鲳鱼块的食用品质，延长货架期，利用响应面Box-Behnken试验设计对茶多酚、溶菌酶和壳聚糖生物保鲜剂进行复配优化，建立以挥发性盐基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量为响应值的二次多项式回归模型。并通过感官评定和菌落总数（aerobic plate count，APC）、TVB-N含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、三甲胺（trimethylamine，TMA）含量、pH值和K值等指标测定对最优配比复合保鲜剂保鲜效果进行验证。结果表明：经方差分析和回归拟合，得到复合生物保鲜剂对鲳鱼块贮藏品质的最佳质量分数配比为：茶多酚1.35%、溶菌酶0.054%和壳聚糖1.38%，且溶菌酶与壳聚糖、茶多酚与壳聚糖对响应值存在显著的交互作用（P＜0.05）。该复合保鲜剂能够显著抑制微生物的生长（P＜0.05），有效降低贮藏过程中TVB-N含量、TBA值、TMA含量，显著延缓鲳鱼块品质的变化，货架期较对照组（4 ℃冷藏）的5～6 d延长至12 d。

水产品；保鲜；响应面法；生物保鲜剂；茶多酚；溶菌酶；壳聚糖

生物保鲜技术因安全性高、适用范围广，能较好地保持食品原有的风味品质，延长货架期而在水产品贮藏保鲜中具有良好的应用前景。而生物保鲜剂种类繁多，抑菌保鲜机理各不相同。茶多酚能够通过清除自由基和抑制微生物的增长等作用，延缓脂肪氧化，提升水产品贮藏期间的品质，延长货架期，溶菌酶对革兰氏阳性菌具有良好的抗菌特性，广泛应用于食品保鲜、医疗、制药等多领域，壳聚糖具有高效的抑菌抗菌效果[1-3]。

根据栅栏技术原理，复合保鲜剂可发挥协同效应，不仅可以达到更好的抑菌保鲜效果，提升食品品质，而且能够减少单一生物保鲜剂的用量，降低生产成本[4]。谢晶等[5]用植酸、壳聚糖和ε-聚赖氨酸组成的复合生物保鲜剂应用于南美白对虾，结果表明优化后的复合保鲜剂不仅成本低廉，而且能够明显延缓南美白对虾的黑变，延长货架期4 d；曹荣等[6]将复合生物保鲜剂用于牡蛎保鲜，结果表明：该保鲜剂处理能够显著降低牡蛎在5 ℃冷藏期间菌落总数和挥发性盐基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量的增长，较不添加保鲜剂处理的对照组货架期延长9 d；Li Tingting等[7]将茶多酚和壳聚糖组成的复合保鲜剂，用于眼斑拟石首鱼的保鲜，货架期较对照组延长达6～8 d。

TVB-N是评价水产品腐败程度的重要指标，其质量分数与水产品的腐败程度呈正相关性[8]；在SC/T 3103—2010《鲜冻鲳鱼》标准中规定，鲳鱼的TVB-N含量一级品不大于18 mg/100 g，合格品不大于30 mg/100 g[9]；贮藏初期冷藏条件下鲳鱼TVB-N含量均保持上升趋势，且在贮藏后期呈急剧增大趋势[10-12]，因此将初期腐败前各不同贮藏时间TVB-N含量总和作为响应值，能较准确地反映各不同处理方式对鲳鱼贮藏品质的影响。

本实验在在单一生物保鲜剂对鲳鱼保鲜的研究基础之上[13]，通过响应面法优化茶多酚、溶菌酶和壳聚糖3 种复合保鲜剂的配比质量分数，通过感官指标、菌落总数和理化指标，对最优复合保鲜剂的保鲜效果进行验证，为生物保鲜剂在水产品贮藏保鲜中的运用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲳鱼购买于上海市浦东新区芦潮港水产品市场，挑选色泽正常，眼球饱满，角膜清晰，肌肉坚实，质量在200～250 g的新鲜鲳鱼，碎冰片保藏，半小时内送到实验室。

茶多酚（食品级，多酚含量≥95%） 陕西普维生物制品有限公司；溶菌酶（食品级，活力≥20 000 U/mg）、壳聚糖（食品级，脱乙酰度≥90.0%）、甲苯（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；标准品三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinix acid，IMP）、次黄嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

LC-2010C HT型高效液相色谱仪 日本岛津公司；inertsil ODP-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱 日本GL Sciences公司；Kjeltec2300半自动凯氏定氮仪 瑞士FOSS公司；雷磁PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司；UV-3000 PC紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；PE保鲜袋 上海城湾工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将壳聚糖溶解在含1%醋酸的蒸馏水中，然后依次加入溶菌酶和茶多酚，使其充分溶解，制成复合保鲜剂。将新鲜的鲳鱼去内脏后用冰水洗净，取躯干部鱼肉块，每块约25 g（5 cm×7 cm），随机分成15 组（每组16 块）。由预实验确定将鲳鱼块浸渍在配制好的复合保鲜剂溶液中5 min，取出于室温沥干，分装到聚乙烯无菌保鲜袋中后，贮藏于4 ℃恒温箱中。

1.3.2 响应面试验设计

利用Box-Behnken试验设计，以茶多酚、溶菌酶和壳聚糖3 种生物保鲜剂的不同质量分数为考察因子，以贮藏期间TVB-N含量的总和（由预实验确定该复合鲳鱼的贮藏时间在9～12 d，取贮藏期间鲳鱼块第0、2、4、6、8、10、12天TVB-N含量的和）作为响应值[14]，建立响应值与考察因子之间的二次多项式回归模型。然后将回归方程求导分析得到复合保鲜剂的最佳配比质量分数（添加量），并与不添加保鲜剂处理的对照组进行验证分析。参考单一保鲜剂试验结果[13]试验因素水平设置如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计的因素和水平Table1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.3.3 指标测定

综合感官评定：根据鲜、冻鲳鱼标准[9]，由5 名受专门培训的感官人员参考鲳鱼感官评定表[15]对鲳鱼块进行综合评分，最后结果取其综合评分值，最高为5 分，最低为1 分，3 分以下为不新鲜（不可接受）；菌落总数（aerobic plate count，APC）的测定：根据GB 4789.2—2010《食品微生物学检验：菌落总数的测定》中菌落总数的测定方法[16]进行测定；TVB-N含量的测定：参考Goulash等[17]的方法，利用凯氏定氮仪进行测定；三甲胺（trimethylamine，TMA）含量的测定：利用苦味酸比色法，参考GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的测定》[18]以及AOAC中水产品三甲胺含量测定方法[19]进行测定；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的测定：参考杨胜平等[20]的方法进行测定；pH值的测定：取剁碎的鲳鱼鱼肉5 g于烧杯中，加入45 mL中性蒸馏水，搅拌均匀后，静置30 min，用精密数显pH计测定pH值；K值的测定：ATP及其降解产物的提取和以及K值的计算参考邱伟强等[21]的方法。HPLC检测条件参考Shi Jianbing等[13]的方法。

1.4 数据处理方法

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应曲面图和等值线图的绘制。应用SPSS 19.0软件进行数据处理，采用Duncans法进行多重比较。利用Origin Pro V8.5软件绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 二次多项式回归模型的建立及显著性检验

表2 Box-Behnken试验设计方案与结果Table2 Box-Behnken experimental design and results

Box-Behnken试验设计方案及结果如表2所示。该响应面共15 个试验点，中心试验重复3 次，以评估试验误差。中心试验平均值为（127.24±0.82）mg/100 g，误差较小，符合试验设计的要求。

对表2数据进行回归拟合，可得到各保鲜剂质量分数对与响应值之间的二次多项式回归方程为Y= 127.24－6.11A＋3.88B＋5.52C－0.28AB－1.48AC＋2.62BC＋6.23A2＋8.89B2＋5.68C2，其中Y为TVB-N含量，A、B、C分别为茶多酚、溶菌酶和壳聚糖3 个因素的水平数。为了进一步验证模型的可靠性，对回归方程进行方差分析，结果如表3所示：回归模型极显著（P＜0.000 1），即该回归方程的相关系数R2为99.99%，实验误差小；而方程的失拟项F值很小，差异不显著（P=0.564 4＞0.05），该二次回归模型是适当的，与实际试验拟合较好，适合鲳鱼块品质变化的预测分析。从表3可以看出，茶多酚、溶菌酶和壳聚糖3 个因素对响应值的影响均为极显著（P＜0.01），且溶菌酶和壳聚糖、茶多酚和壳聚糖质量分数对响应值存在显著的交互作用（P＜0.05）。

表3 响应面回归方程的方差分析Table3 Analysis of variance of the fitted regression equation

2.2 响应曲面分析及最佳配比的确立

图1 各因素交互作用对TVB-N含量的影响Fig.1 Response surface plots for the effects of tea polyphenols, lysozyme and chitosan on TVB-N value

模型的三维响应面图可以比较直观地反映因素对响应值的影响，如图1a所示，当壳聚糖的质量分数在0水平，茶多酚质量分数在一定水平时，随溶菌酶质量分数的升高，TVB-N总含量下降，但质量分数继续增大，TVB-N总含量反而上升。这可能是由于溶菌酶能够强力作用于革兰氏阳性菌等微生物的细胞壁，使微生物的含量降低，从而使生成的TVB-N含量下降；然而溶菌酶本身是蛋白质，且作用特异性高，溶菌酶质量分数太高反而成为革兰氏阴性菌等微生物的营养成分，促进革兰氏阴性菌等生长迅速，结果会导致其TVB-N含量的上升，而不利于鲳鱼的贮藏保鲜[22-23]。如图1c所示，当茶多酚质量分数在0水平时，溶菌酶质量分数在一定水平时，随壳聚糖质量分数的升高，TVB-N含量也呈先下降后上升的趋势。可能原因是壳聚糖主要作用于细菌的外表面，适当低质量分数的壳聚糖中带正电荷的壳聚糖氨基中和细菌表面的负电荷，使细菌细胞胶合，抑制大量细菌的增长，使TVB-N含量降低，而高质量分数的壳聚糖使细菌细胞表面带上正电荷而处于悬浮状态而不胶合[24]，细菌还有一定的繁殖能力，使TVB-N的含量上升。

等值线的形状可反映出因素间交互作用的强弱，其中椭圆形表示2 个因素交互影响显著，而圆形则表示2 个因素较交互作用较弱[25]。通过图1等高线可知，溶菌酶和茶多酚交互作用较弱，而溶菌酶和壳聚糖、茶多酚和壳聚糖交互作用显著。

通过对回归方程求导和响应面分析，得到茶多酚、溶菌酶和壳聚糖组成的复合保鲜剂的最优配比质量分数分别为：1.35%、0.054%和1.38%（对应的因素水平分别为0.7、0.14和－0.62）。在此条件下，TVB-N总含量的预测值为125.89 mg/100 g。

2.3 复合保鲜剂对鲳鱼块保鲜效果验证

2.3.1 综合感官评定

将该复合保鲜剂应用于鲳鱼块保鲜的验证实验，实验平行2 次。

表4 鲳鱼块感官品质评定结果（n=5）Table4 Sensory evaluation scores of pomfret fillets ( = 5)

感官评定结果如表4所示，随着贮藏时间的延长，对照组感官得分较处理组下降趋势明显，第6天对照组感官得分低于3 分，为不可接受。在第6天以后处理组显著高于对照组（P＜0.05），在第12天以后才不可接受。可见复合保鲜剂能够有效减缓贮藏过程中综合感官品质的下降趋势，使其在较长时间内仍保持在可接受范围。

2.3.2 APC的变化

图2 不同处理鲳鱼块APC的变化Fig.2 Change in APC in pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

两实验组的APC变化如图2所示。在贮藏相同时间的对照组APC含量显著高于处理组（P＜0.05），对照组第6天已经超出限量标准（7.0 lg（CFU/g））[26]，达7.4 lg（CFU/g），而复合保鲜剂处理组在第6天只有4.0 lg（CFU/g），到第12天才达限量标准，可见复合保鲜剂能够显著抑制鲳鱼块微生物的生长（P＜0.05）。Li Tingting等[27]用茶多酚和壳聚糖组成的复合生物保鲜剂对大黄鱼的研究中也得到类似的抑菌效果。与茶多酚、溶菌酶、壳聚糖3 种保鲜剂中的只有一种保鲜剂作用于鲳鱼块时的APC[13]（第0天的APC最低为3.97l g（CFU/g），贮藏过程中保持增长趋势）相比明显偏低。可见复合生物保鲜剂的协同作用扩大了单一生物保鲜剂抑菌范围，使抑菌效果也得到增强，从而延长鲳鱼块的货架期。

2.3.3 TVB-N含量的变化

图3 不同处理鲳鱼块TVB-N含量的变化Fig.3 Change of TVB-N of pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

不同处理鲳鱼块的T V B-N含量变化如图3所示，对照组在第6天已接近限量标准，在第8天已达54.5 mg/100 g，而处理组上升趋势缓慢，在第4天以后显著低于对照组（P＜0.05），到第12天才接近限量标准。Seyed等[26]用壳聚糖处理虹鳟鱼的TVB-N得到类似的变化趋势，可能原因是在贮藏前期鲳鱼块内源酶的活性较低和微生物数量较少，生成TVB-N的含量保持在较低水平，贮藏后期随微生物数量的增加和内源酶活性的增强，生成TVB-N的含量急剧增加。贮藏前12 d鲳鱼块的TVB-N含量为124.36 mg/100 g，与预测值125.89 mg/100 g接近。这也表明了Box-Behnken试验方法优化复合保鲜剂配比准确可靠，验证了上述模型的合理性。

2.3.4 TBA值的变化

图4 不同处理鲳鱼块TBA值的变化Fig.4 Change in TBA of pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

TBA值反映了水产品脂肪氧化的程度。如图4所示，从第2天开始，处理组TBA值显著低于对照组。在第6天对照组TBA值为0.59 mg/100 g，而处理组在第12天的TBA值才达0.41 mg/100 g，复合保鲜剂处理显著减缓了鲳鱼块脂肪氧化的速率（P＜0.05），这与Li Tingting等[28]的研究结果类似。可能原因是一方面由于壳聚糖在鲳鱼块表面形成保护膜，阻隔了氧的进入[30]；另一方面是复合保鲜剂通过降低了微生物的代谢速率，抑制微生物的增长，使生产自由基和其他氧化引发剂等促进脂肪氧化物质的含量降低，从而延缓了脂肪的氧化。

2.3.5 TMA含量的变化

图5 不同处理鲳鱼块TMA含量的变化Fig.5 Change in TMA-N in pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

水产品在贮藏过程中，鲜味主要来源物质氧化三甲胺在腐败细菌或氧化三甲胺酶的作用下可被还原成TMA，TMA含量越高，其鲜度越差。如图5所示，第2天以后对照组TMA增长迅速，到第4天已显著高于处理组（P＜0.05），而处理组TMA含量在第12天以后才急剧增加。可能是由于复合保鲜剂处理能够明显抑制产TMA菌等微生物的增长，随微生物的数量大量增加，TMA含量急剧增长，这与菌落总数的变化趋势一致。

2.3.6 pH值的变化

图6 不同处理鲳鱼块pH值的变化Fig.6 Change in pH of pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

不同处理的鲳鱼块pH值的变化如图6所示，含1%醋酸的保鲜剂处理组鲳鱼块pH值显著低于对照组（P＜0.05）。在第2天以后，对照组pH值急剧上升，而处理组pH值在第10天以后才上升迅速。与Song yongling等[30]用茶多酚结合海藻酸钠组成的复合生物保鲜剂处理鲷鱼的研究结果类似。可能是因为在贮藏前期经复合保鲜剂处理，微生物数量较低，蛋白的分解产生胺类等碱性物质含量较低，第10天以后而随微生物数量的增加，产生大量的碱性物质，pH值急剧上升，这与TVB-N和TMA含量变化相一致。

2.3.7 K值的变化

图7 不同处理鲳鱼块K值的变化Fig.7 Change in K value of pomfret fillets treated or nor with the composite biopreservative during storage

K值是反应水产品早期鲜度的重要指标。一般认为水产品的一级鲜度K值在20%以下，二级鲜度为20%～40%，60%以下可供食用与加工，60%～80%为初期腐败[31]。如图7所示，对照组和处理组的K值均保持上升趋势，但处理组K值始终低于对照组，而在第6天以后处理组才显著低于对照组（P＜0.05），在第8天对照组和处理组K值均超过60%，可见复合保鲜剂对ATP的降解有一定的抑制作用，Li Tingting[7]、Fan Wenjiao[32]等也得到类似的研究结论。处理组与对照组相比，其K值变化并不如与APC、TVB-N、TBA、pH值明显，这可能是因为复合保鲜剂主要是抑制鲳鱼块贮藏期间微生物的数量，而对鱼肉本身生物化学反应和酶的活性影响并不是很大。

3 结 论

Box-Behnken 试验设计响应面法能够准确优化茶多酚、溶菌酶和壳聚糖组成的复合生物保鲜剂对鲳鱼块保鲜品质的配比质量分数，二次多项式回归方程的相关系数R2达99.99%。茶多酚、溶菌酶和壳聚糖的最优配比质量分数分别为1.35%、0.054%、1.38%。茶多酚与壳聚糖质量分数、溶菌酶与壳聚糖质量分数对鲳鱼块的保鲜品质具有显著的交互作用（P＜0.05），而茶多酚与溶菌酶质量分数交互作用则不明显。

通过鲳鱼块保鲜的验证实验，复合保鲜剂能够有效减缓综合感官品质的下降趋势，使其在较长时间内仍保持在可接受范围。

优化配比的复合生物保鲜剂存在较强的协同作用，从第0天开始就能显著减少了微生物的数量（P＜0.05），有效减缓TVB-N含量、TMA含量、TBA值的增长速率，而在贮藏后期对K值的作用不是很明显。该复合保鲜剂能够有效延缓鲳鱼块的腐败，货架期较单冷藏条件下的5～6 d延长到12 d。

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Optimization of Complex Biopreservatives to Improve Quality Preservation of Pomfret Fillet by Response Surface Methodology

SHI Jian-bing, XIE Jing*, GAO Zhi-li, SU Hui, WU Yan, ZHANG Fu-yu
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The purpose of this study was to optimize complex preservatives consisting of tea polyphenols, lysozyme and chitosan using response surface methodology based on Box-Behnken experimental design to improve quality preservation of pomfret fi llets and prolong their shelf life. A quadratic polynomial regression model was established with total volatile basic nitrogen (TVB-N) as the response value. The results indicated that the best formulation of complex preservative was composed of 1.35% tea polyphenols, 0.054% lysozyme and 1.38% (m/m) chitosan by analysis of variance and regression fi tting. Tea polyphenols and chitosan, as well as lysozyme and chitosan had a signifi cant interactive effect on the quality of pomfret fi llets during storage (P ＜ 0.05). TVB-N, aerobic plate count (APC), thiobarbituric acid (TBA), trimethylamine (TMA), pH and K value of pomfret fi llets treated with the optimized complex preservative were determined and their sensory scores were evaluated during storage at 4 ℃. The results showed that the optimal complex preservative could signifi cantly reduce the contents of TVB-N, TBA and TMA, and inhabit the growth of microorganisms (P ＜ 0.05). Hence the complex preservative could effectively delay the deterioration of pomfret fi llets, prolonging the shelf life to 12 days compared to 5-6 days for the control group.

aquaculture; freshness preservation; response surface methodology; biopreservative; tea polyphenols; lysozyme; chitosan

S983

A

1002-6630（2014）20-0037-06

10.7506/spkx1002-6630-201420008

2014-02-04

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD24B02）；2013年上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字（2013）第3—4字]

施建兵（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品保鲜。E-mail：shijianbingv@126.com

*通信作者：谢晶（1968—），女，教授，博士，研究方向为食品工程。E-mail：jxie@shou.edu.cn