冯燕艳 吴卫东 普雄明

ERAP1 内质网氨基肽酶(endoplasmic reticulum aminopeptidase，ERAP)又名与抗原递呈相关的内质网氨肽酶，分布于细胞表面和内质网，具有复杂多样的生物学功能，如参与血管形成、蛋白水解、抗原加工和递呈，调节天然免疫反应、抗细菌等。人类基因组中有2 个高度同源的ERAP 基因，分别编号为ERAP1 和ERAP2。研究发现ERAPl 参与许多恶性肿瘤的发生、发展及浸润转移过程［1，2］。目前研究发现ERAP1 基因与强制性脊柱炎和银屑病发病相关，但对其作用机制和调控机制尚缺乏深入研究［3，4］。

实时荧光定量PCR 是目前进行核酸定量检测较为准确的方法，可检测组织中mRNA 含量，标准品的制备是实时荧光PCR 进行定量的基础。考虑到标准品的稳定性，把目的片段重组至质粒中得到稳定的重组质粒，是制备荧光定量PCR 标准品的一种策略。本研究采用T-A 克隆法成功构建了用于ERAP1 基因实时荧光定量PCR 检测的标准质粒。

材料与方法

1.实验材料:手术切取人类皮肤约30g。通过GenBank 报道的人ERAP1 基因序列，使用Oligo 6.0 结合Primier 5.0 引物设计软件进行引物设计。目的片段大小为120bp，由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物(P1):5' -ACAGATGGTGTAAAAGGGATGG - 3，下游引物(P2):5' - GCAGTGTCCAAGTGTTCATCAT-3'。pMDl9 -T 载体购自宝生物有限公司。pMDl9 -T 载体购自宝生物有限公司。大肠杆菌DH5α、琼脂糖凝胶DNA 片段回收纯化试剂盒、质粒DNA 纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。Real - time PCR 试剂盒、SYBR Green Ⅰ试剂购自QIAGEN 公司。

2.实验方法:(1)使用异氰酸胍、三氯甲烷抽提法提取人皮肤组织总RNA:将约30g 皮肤组织中加入液氮中研磨，尽量磨碎，加入1ml TRNzol，15 ～30℃静置5min，4℃13000r/min离心10min，吸上清于一新管中，加入200μl 氯仿，上下颠倒剧烈振荡15s，15 ～30℃静置2 ～3min，4℃13000r/min 离心15min，将上清液小心转移到Rnase -free 的1.5ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，混合均匀。15 ～30℃静置10min，4℃12000r/min 离心10min。弃去上清，1000μl 70%的乙醇洗涤1次沉淀，4℃7500r/min 离心5min，倒掉液体，静置干燥，待乙醇挥发干净，加30μl ddH2O 水，反复吹打溶解，-70℃保存。得到的总RNA 使用核酸蛋白分析仪定纯度和浓度。1%琼脂糖电泳检测后，可见28S、18S、5.8S 条带，RNA 纯度在1.80 以上，总RNA 质量符合要求。(2)反转录合成cDNA:反转录反应使用TAKARA 公司AMV 反转录酶按40μl 体系进行反转录，使用QIAquick PCR Purification Kit 进行cDNA 的纯化。(3)PCR 扩增目的基因:以所提取并纯化的cDNA，进行普通PCR，扩增出标准DNA 片段。配置25μl 反应体系进行PCR反应，PCR 反应条件为:94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35 次循环，72℃延伸5min。对PCR 产物2%琼脂糖电泳，对目的片段进行切胶回收。(4)重组质粒pMD19 -T Vector -GAPDH 的转化、筛选及鉴定:将胶回收产物以1∶3 比例由T4DNA 连接酶连接到pMD19 -T Vector，将连接产物转化入DH5α 感受态细胞中，涂布在含X -GAL 和IPTG 的氨苄青霉素平板中。37℃过夜培养，约14h 后菌落形成，挑选白色菌落，进行菌落PCR 检测，检测阳性者，加入有5ml 氨苄LB 培养基的15ml 离心管中，于37℃摇床中震摇培养12 ～16 h，收集菌液送上海生工进行测序，Chromas 软件分析测序结果。(5)质粒提取及酶切:测序正确菌液提取质粒，使用Promega 公司的Wizard Plus SV Minipres DNA Purification System 的试剂盒提取质粒，以BamHⅠ进行过夜酶切使其线性化，酶切产物用DNA 纯化回收试剂盒进行纯化。测A260 和A280 以分析纯度，并计算原始拷贝浓度。(6)Real-time PCR标准曲线的建立:1)梯度浓度标准品质粒溶液的准备:通过公式计算回收纯化产物(DNA)原液的拷贝数。计算公式如下:DNA 拷贝数(copies/μl)=C ×10-9×6.02 ×1023/M ×660，其中C 为质粒DNA 的质量浓度(ng/μl)，M 为质粒DNA 的碱基对数(空载体碱基对数+ 插入目的片段碱基对数)，6.02 ×1023为阿佛加德罗常数。将重组质粒标准品原液进行10 倍倍比稀释成108～104copies/μl 梯度数量级的标准品，进行Real-time PCR 扩增。2)荧光定量PCR 测标准曲线:检测使用QuantiTect SYBR GEEN 试剂(Qiagen)进行real - time PCR(Light Cycler 2.0，Roche)生成ERAP1 基因的标准曲线。Real-time PCR 反应体系:SYBR Green 荧光染料10μl，上下游引物各0.5μl，质粒DNA 2μl，ddH2O 7μl;反应条件:Denaturation 95℃5min;Amplification 95℃30s，55℃30s，72℃30s，45 个循环;Melting curve 95℃1s，40℃1s。

结 果

1.总RNA 的提取与检测:琼脂糖凝胶电泳检查提取的总RNA，其条带清晰，1% 琼脂糖凝胶电泳100 伏15min 电泳结果见图1。

2.DNA 片段普通PCR 产物电泳:以cDNA 为模板进行普通PCR，ERAP1 基因PCR 产物电泳图见图2。

图1 RNA 电泳图

图2 ERAP1 基因PCR 产物2%琼脂糖凝胶电泳图

3.酶切质粒电泳:提取的质粒需要经过酶切线形化后，才能进行梯度稀释进行标准曲线的生成。酶切线形化质粒电泳结果如图3。

图3 PUC18 -ERAP1 重组质粒双酶切鉴定

4.重组质粒的测序鉴定:重组质粒酶切片段测序，将测序结果与GenBank 提供的序列比较，结果完全重合，表明重组质粒PUC18 - ERAP1 构建成功。

5.基因标准曲线图:基因标准曲线制备，不同梯度质粒1、1 ×10-1、1 ×10-2、1 ×10-3、1 ×10-4和1 ×10-5ng/μl real -time PCR 标准曲线图，标准曲线图由软件自动生成，结果见图4。real -time PCR 构建的标准曲线(图4)斜率达-3.935，灵敏度达1.0 ×104拷贝/毫升，线性范围为1.0 ×104～1.00 ×108拷贝/毫升，阈值循环数(Ct)与PCR 体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r2=0.978)，扩增效率高(E =89.916%)。经过熔解曲线测定，其Tm 值为78.65℃，主峰位置重叠(图5)。

图4 ERAP1 基因扩增曲线图

图5 ERAP1 基因熔解曲线

讨 论

本实验以从人类皮肤中提取全基因组RNA，并反转录为cDNA，用该cDNA 为模板PCR 扩增出120 bp 的片段，通过T - A 连接重组至pMD19 - T 载体中，并转化入DH5α 受体菌，经Amp+抗性筛选获得阳性克隆。经PCR 扩增、双酶切鉴定和序列分析，证明成功构建了标准品重组质粒，对质粒模板进行不同浓度梯度稀释，实时荧光定量PCR 结果分析，所获得的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系。且PCR 产物为单一的主峰，证明该外标准品为ERAP1 序列上的特异性产物。上述结果表明，构建的重组质粒完全可以作为ERAP1 基因荧光定量检测的参照标准。

ERAP1 内质网氨基肽酶1 基因(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1)又名与抗原递呈相关的内质网氨肽酶，位于5q15，属于锌指金属基质肽酶M1 家族中的“缩宫素酶亚家族”，在人类细胞均由IFN-γ 和TNF-α 诱导表达［5，6］。参与许多生化过程:在细胞内质网中参与内源性抗原肽的修饰及递呈，被认为是内质网中参与内源性抗原肽修饰的关键酶［7］，参与调节血压和血管生成及细胞因子受体的脱落［8］。而来自GNF 的数据显示，ERAP1 基因mRNA 在正常皮肤组织和皮肤肿瘤组织均有表达，但表达量差别不大。

本实验所需样本为皮肤组织，由于目前常规活检手术所取皮肤组织包含部分真皮的纤维组织，研磨相对困难，故目前提取皮肤组织RNA 方法多为使用试剂盒，虽然提取过程中需要组织较少、实验要求相对偏低，但费用昂贵，笔者预实验结果显示所提取RNA含量相对较低;但本研究只需30g 新鲜皮肤组织，取材后液氮保存，随后尽量保持液氮中研磨，防止RNA降解，随后进行常规异氰酸胍、三氯甲烷抽提法提取人皮肤组织总RNA，所提取的基因组RNA 浓度、纯度也能达到反转录标准，反转录后DNA 片段作为PCR 模板，也能获得预期效果。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。本研究过程中已获得了优化的实时定量PCR 反应程序，为继续开展ERAP1mRNA 检测创造了良好的条件，为今后针对性检测不同来源、不同病种ERAP1 的RNA 含量，并为进一步进行功能研究打下了一定基础。

1 Fruci D，Giacomini P，Nicotra MR，et al. Altered expression of endoplasmic reticulum aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 in transformed non-lymphoid human tissues［J］. Cell Physiol，2008，216(3):742 -749

2 Liu B，Li DR，Ni P，et al. Expression and significance of differentially expressed protein endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 in ovarian carcinoma with lymph node metastasis［J］. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2010，45(1):41 -44

3 Sun LD，Cheng H，Wang ZX，et al. Association analyses identify six new psoriasis susceptibility loci in the Chinese population［J］. Nat Genet，2010，42(12):1005 -1009

4 Stuart PE，Nair RP，Ellinghaus E，et al. Genome -wide asso - ciation analysis identifies three psoriasis susceptibility loci［J］. Nat Genet，2010，41(12):1000 -1004

5 Tsujimoto M，Hattori A. The oxytocinase subfamily of M1 aminopeptidases［J］. Biochim Biophys Acta，2005，1751:9 -18

6 Forloni M，Albini S，Limongi MZ，et al. NF-kappaB，and not MYCN，regulates MHC class I and endoplasmic reticulum aminopepti -dases in human neuroblastoma cells［J］. Cancer Res，2010，70:916 -924

7 Saveanu L，Carroll O，Lindo V，et al. Concerted peptide trimming by human ERAP1 and ERAP2 aminopeptidase complexes in the endoplasmic reticulum［J］. Nat Immunol，2005，6:689 -697

8 Yamamoto N，Nakayama J，Yamakawa-Kobayashi K. Identification of 33 polymorphisms in the adipocyte - derived leucine aminopeptidase(ALAP)gene and possible association with hypertension［J］. Hum Mutat，2002，19:251 -257