孔玉珊，黄少兰，谢明霞，薛艳红，邹 坤，刘士平

天然产物研究与利用湖北省重点实验室 三峡大学生物与制药学院，宜昌 443002

排风藤(Solanum cathayanum)又称千年不烂心、蜀羊泉等，是我国特有的一种茄属植物，主要分布于三峡流域及神农架、恩施和湘西等地［1］。作为一种民间草药，排风藤具有清热利湿、解毒消肿的功效，在三峡库区具有多年的使用历史［2］。本实验室的前期研究表明，排风藤的部分提取物不仅可杀菌抗炎、保肝护胆［3］，而且对神经细胞具有较好的抗氧化保护能力［3］，具有可作为治疗神经退行性疾病(如帕金森症，阿尔茨海默病和亨廷顿氏病等)药物的潜能［4］。为进一步探讨排风藤提取物在神经元氧化损伤中的保护作用，本实验室从排风藤中分离出9个单体化合物［1，5］，经结构鉴定其中一种为东莨菪苷(Scopolin)。本文分析了东莨菪苷的细胞毒性，进行了过氧化氢胁迫下人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 的氧化损伤保护作用分析，试验结果表明东莨菪苷具有有效的抗H2O2介导的氧化损伤作用，具有缓解细胞膜损伤、恢复超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物质的含量，为新型神经退行性疾病药物的开发和设计提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

排风藤采自湖北恩施，经三峡大学生物与制药学院陈发菊教授鉴定为Solanum cathayanum。人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 由华中科技大学同济医学院实验动物中心惠赠。

1.2 药品和仪器

实验中使用的药品和试剂有:胰蛋白酶(美国GIBCO 公司)，四氮唑蓝(MTT)(美国AMRESCO 公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，过氧化氢(H2O2，分析纯，国药集团)，LDH、SOD、GSH 检测试剂盒(上海宝曼生物公司)。其中D-MEM/F-12 完全培养基内含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，15%新生小牛血清。基础培养基将新生小牛血清降为3%。所用的仪器有酶联免疫检测仪(Genios Tecan);CO2培养箱(日本三洋公司)，LD4-2A 离心机(北京医用离心机厂)，XDS-1B 倒置显微镜(重庆光学仪器厂)和96 孔板(美国Corning 公司)。

1.3 东莨菪苷的分离与鉴定

取6.5 kg 排风藤干燥全草粉碎，95%乙醇回流提取3 次，每次2～3 h，过滤，滤液减压浓缩至无醇味后用石油醚脱脂。脱脂后的水层用4% HCl 冷浸3 次，用Na2CO3调至成不同的pH(7、10、12)后经氯仿萃取三次，最后水层再用正丁醇萃取得正丁醇部位(260.2 g)。将正丁醇部位水悬浮后，其水溶部分经大孔吸附树脂和反相硅胶柱层析，经HPLC 制备获得30 mg 样品。将该化合物进行硅胶薄层色谱、重氮化氨基苯磺酸反应、Molish 反应和核磁共振后确定其结构。

1.4 细胞培养及H2O2损伤模型的建立

SH-SY5Y 细胞用D-MEM/F-12 完全培养基于37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞80%～90% 铺满瓶底时进行传代、转板，贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化，传代按1∶3 比例进行。H2O2损伤模型的建立按照［3］的方法进行。

1.5 东莨菪苷对神经细胞毒性检测

取对数生长期的SH-SY5Y 细胞以1 ×105个/mL 的浓度接种于96 孔板，100 μL/孔，培养24 h 贴壁后弃去旧培养基，加入浓度为0.1、1、10、100、1000 μM 的药物(含3%血清的培养基配制)，同时设空白对照组，每组设6 次重复，继续培养24 h，MTT 比色法在492 nm 处检测吸光值并计算细胞存活率［6-8］(存活率=处理组OD 值/空白组OD 值×100%)。

1.6 东莨菪苷对神经细胞抗氧化保护活性及量效关系分析

根据毒性实验结果，选取100 μM 以下的浓度先进行初筛。弃去旧培养基后，模型组及给药组加入浓度为700 μM 的双氧水(无血清培养基配制)，培养12 h 后用MTT 比色法检测细胞存活率。量效关系分析中将浓度设置为0.01、0.1、1、10、100 μM，同时设空白组、模型组及正对照维生素E(VE)组(VE 的浓度为5 mg/mL)。

1.7 乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)检测

利用黄递酶法分别检测细胞内外的LDH，计算漏出率。LDH 漏出率=［细胞外值/(细胞外值+细胞内值)］×100%。LDH、SOD、GSH 检测的具体操作均按上海宝曼生物公司的试剂盒说明进行。

1.8 统计学处理

2 结果与分析

2.1 东莨菪苷的结构鉴定

分离纯化后的样品呈白色粉末状，mp.203～204 ℃。硅胶薄层色谱在365 nm 紫外灯下观察呈蓝色荧光斑点，UVλMeOHnm:203 nm、275 nm，提示该化合物有较大的共轭体系，重氮化氨基苯磺酸反应呈阳性，提示该化合物可能是香豆素类化合物。Molish 反应呈阳性，原位酸水解只检测到葡萄糖。ESIMS m/z:355 ［M+H］+。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δH:7.97 (1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，7.29 (1H，s，H-8)，7.16 (1H，s，H-5)，6.33 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，5.00 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1')，3.81(3H，s，6-OCH3);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δC:160.4 (C-2)，149.8 (C-7)，148.8 (C-9)，145.9(C-6)，144.1 (C-4)，113.4 (C-5)，112.2 (C-10)，109.6 (C-3)，105.5 (C-8)，102.9 (C-1')，77.0 (C-3')，76.2 (C-5')，72.9 (C-2')，69.5 (C-4')，60.6(C-6')，55.9 (6-OCH3)。以上数据与文献［9］报道一致，故鉴定化合物为东莨菪苷(scopolin)，其化学结构式见图1。

图1 东莨菪苷的化学结构Fig.1 Chemical structure of scopolin

2.2 东莨菪苷对神经母瘤细胞生长的影响

为明确东莨菪苷对神经细胞的生长是否具有毒害作用，并寻找到合适的药物浓度范围，试验中我们考察了不同浓度的单体对SH-SY5Y 细胞存活率的影响。结果显示(表1)东莨菪苷对SH-SY5Y 细胞的毒性作用随着浓度的增加而增强:当浓度达到100 μM 时，细胞的生长会受到影响;而当浓度升高到1000 μM 时，细胞的存活率仅有对照的82.23%。统计分析还表明，当用0～100 μM 浓度的东莨菪苷进行处理时，其对SH-SY5Y 细胞的毒害作用较小，因此选用此浓度范围进行抗氧化保护作用分析。

表1 东莨菪苷对SH-SY5Y 细胞生长的影响Table 1 Effect of scopolin on growth of SH-SY5Y cells

2.3 东莨菪苷的抗氧化能力分析

在建立了700 μM 双氧水氧化胁迫模型的基础上，我们分析了东莨菪苷对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 的抗氧化活性分析。MTT 比色法实验结果显示东莨菪苷对双氧水损伤的SH-SY5Y 细胞具有明显的保护作用。在0.01～100 μM 浓度范围内东莨菪苷均显示出很好的抗氧化活性，保护细胞免于遭到双氧水的氧化损伤，其效果优于阳性对照VE(图2)。但在所试验的浓度范围内，其量效关系不明显。

图2 东莨菪苷对SH-SY5Y 细胞的抗氧化保护作用Fig.2 Protective effect of scopolin on SH-SY5Y cells under H2O2oxidative stress

2.4 LDH、SOD、GSH 检测

为进一步分析排风藤提取物东莨菪苷对神经细胞的氧化保护作用机理，我们分别测定了SH-SY5Y细胞在不同东莨菪苷浓度(0.001、0.01 和0.1 μM)下的LDH、SOD、GSH 值(图3)。实验结果表明，在细胞正常生长时，LDH 的活性主要集中在细胞内，可700 μM 的H2O2使得LDH 的漏出率达到近30倍(图3A)，即H2O2导致神经细胞的氧化损伤部分原因是由于细胞膜受损，使得胞内LDH 的活性降低，胞外LDH 活性增高。但东莨菪苷可与阳性对照VE 一样，起到部分降低LDH 漏出率的作用，在浓度超过0.01 μM 时效果明显(图3A)，说明东莨菪苷可以降低因H2O2导致的细胞膜损伤，从而起到保护神经细胞的作用。

在H2O2存在下，SH-SY5Y 细胞的SOD 酶活显著下降(图3B)。VE 可以显著恢复其活性(恢复率:68%)，而东莨菪苷对其也有很好的恢复效果(图3B)，在0.1 μM 时SOD 酶活可以恢复到正常生长的63%。GSH 活性检测的结果和SOD 类似，H2O2使得GSH 的活性下降80%以上(图3C)，VE和0.1 μM 的东莨菪苷使得其活性得以部分恢复，恢复度达40%以上(图3)。这一系列实验结果表明，东莨菪苷对神经细胞的抗氧化保护作用，除了可以减少膜损伤之外，还可以显著提高抗氧化酶的活性。

3 讨论

活性氧可诱导神经细胞发生凋亡，是造成许多退化性神经系统疾病的一种重要诱因。故找到合适的抗氧化剂，保护神经元免受氧化应激损伤，是防治该类疾病的有效途径。前期研究表明排风藤的提取物对神经细胞具有较好的抗氧化保护能力［3］，本文在前期研究的基础上从排风藤中分离了一个单体化合物——东莨菪苷，并探讨了其对神经母瘤细胞SH-SY5Y 的抗氧化保护活性，结果表明在0.01～100 μM 浓度范围内东莨菪苷均显示出很好的抗氧化活性，其效果甚至优于阳性对照VE，因此为神经退行性疾病的药物设计提供了一定的参考价值。

图3 东莨菪苷对神经细胞LDH 漏出率(A)、SOD 酶活(B)及GSH(C)活性影响Fig.3 Influence of scopolin on LDH leakage (A)，SOD (B)and GSH (C)activities of SH-SY5Y cells

作为一种潜在药物，东莨菪苷具有抗炎、镇痛的效果，可用于治疗风湿痛和神经痛等疾病，显示出很大的潜在药用价值［1-3］。但是其对神经细胞的抗氧化保护作用机理却很复杂，本文研究结果表明，东莨菪苷既可以一定程度上保护细胞膜免遭损伤，又可以恢复神经细胞抗氧化酶(SOD)或抗氧化剂(GSH)的活性，这些生理指标均接近正对照VE。其中，不管是VE 还是东莨菪苷，其对SOD 和GSH的恢复度均分别可达到正常生长的60%和40%(图3);相比之下，东莨菪苷和VE 对LDH 漏出率的作用有限，是正常生长的15～20 倍(图3)，反映细胞膜的损伤度仍较高。这一些说明东莨菪苷介导的神经细胞的抗氧化作用，机制复杂多样，其详细机理还有待进一步研究。

1 Xie MX(谢明霞)，Zhou Y(周媛)，Zou K(邹坤)，et al.Chemical constituents of the Solanum cathayanum.J Chin Med Mater (中药材)，2008，31:1332-1334.

2 Guo JH (郭江红)，Zhou Y (周媛)，Liu R (刘蓉)，et al.Determination of tomatine in Solanum cathayanum by RPHPLC.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2010，35:882-884.

3 Huang SL (黄少兰)，Dong WJ (董文娟)，Xue YH (薛艳红)，et al.Protective effect of alkaloid of Solanum cathayanum on SH-SY5Y cell damage caused by H2O2.Jiangsu J Trad Chin Med (江苏中医药)，2011，43:90-92.

4 Milton NG.Role of hydrogen peroxide in the aetiology of Alzheimer's disease:implications for treatment.Drugs Aging，2004，21:81-100.

5 Zuo XM(左小明)，Deng ZS(邓张双)，Guo ZY(郭志勇)，et al.Isolation and identification of chemical constituents of Solanum cathayanum.J Huazhong Norm Univ，Nat Sci(华中师范大学学报，自科版)，2012，46:322-324.

6 Wu D(吴迪)，Wu GR(吴桂荣)，Abulizi A(阿布力孜·阿布杜拉)，et al.Preventive effect of different ω-3/ω-6 constituent ratio of compatibility safflower seed oil on SH-SY5Y cells against oxidative cell damage.Nat Prod Res Dev (天然产物研究与开发)，2011，23:420-424.

7 Sun FL(孙芳玲)，Wang W(王文)，An Y(安宜)，et al.Morroniside inhibits H2O2-induced oxidative injury in SHSY5Y neuroblastoma cell.Chin Remed Clin (中国药物与临床)，2008，8:843-845.

8 Yu J(余涓)，Hu GF(胡桂芳)，Weng SM(翁绳美)，et al.Protective effects of 13-MTD on injury of SH-SY5Y neuroblastoma cells induced by hydrogen peroxide.Chin J Clin Pharm Ther (中国临床药理学与治疗学)，2010，15:622-626.

9 He L (何雷)，Yang SL (杨顺丽)，Wu DS (吴德松)，et al.Coumarins from Skimmia arborescens and its anti-inflammatory effect.Chin J Chin Mater Med (中国中药杂志)，2012，37:811-813.