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(青岛大学医学院,山东 青岛 266003 1 附属医院妇产科； 2 基础学院病原微生物学教研室)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，尽管通过手术、放化疗等治疗，绝大多数病人预后较好，但一部分病人仍有转移或复发的可能性，且转移或复发后预后较差[1]。因此，尽早诊断转移病灶并有效治疗肿瘤是目前研究的热点。已有研究表明，某些基因虽然并不参与肿瘤的发生，但是其功能的丧失与原发肿瘤发生转移密切相关[2]。因此，这些基因的研究对肿瘤诊治有着新的意义。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)转染成功后表达的抑制蛋白可以抑制肿瘤细胞的转移，因此成为了目前肿瘤学研究的新靶点[3]。已有研究证实，RKIP在多种恶性肿瘤的转移中发挥重要作用[2-3]，而目前关于其与宫颈癌细胞增殖与转移关系的研究相对较少。为了进一步揭示RKIP在宫颈癌转移中的作用，本文采用脂质体法，用反义及空白RKIP质粒转染宫颈癌Caski细胞，建立RKIP表达下调的稳定转染细胞系，进而研究RKIP表达下调对宫颈癌细胞增殖的影响。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

宫颈癌Caski细胞株来自青岛大学医学院基础实验室，采用含体积分数0.10 FBS的DMEM培养基，在适宜条件下培养。含有人全长RKIP基因的反义质粒asRKIP、空白质粒pcDNA3.1(-)，由美国密西根大学Evan T.Keller教授惠赠。DMEM培养基(Hyclone公司)；G418、Lipofectamine 2000转染试剂盒(Gibco公司)；羊抗人抗体(Abcam公司)；小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Transwell细胞小室(Corning公司)；鼠抗羊多克隆抗体(北京博奥森公司)；PVDF膜、ECL试剂盒(Amershan Pharmacia公司)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞转染 转染前1 d，将Caski细胞接种于6孔板中，每孔(2～5)×105个细胞。第2天细胞达到约90%融合时，采用脂质体法，分别将反义质粒asRKIP和空白质粒pcDNA3.1(-)转入宫颈癌Caski细胞中。1 d后，将细胞按 1∶10传代，用含G418的DMEM(质量浓度为500 mg/L)筛选转染后的两种Caski细胞。10 d～2周后空白对照细胞Caski-(-)死亡后，选出G418抗性克隆细胞，用200 mg/L G418继续培养，建立稳定转染的Caski细胞系，分别命名为Caski-asRKIP和Caski-(-)。将asRKIP转染后Caski细胞分为平行的两组,分别命名为Caski-asRKIP#1细胞和Caski-asRKIP#2细胞。

1.2.2Western Blotting法检测各细胞中RKIP蛋白的表达 取对数期的转染后Caski-asRKIP和Caski-(-)细胞，加入细胞裂解液裂解30 min，提取细胞总蛋白质，采用Bradford方法检测总蛋白的浓度。取40 μg细胞总蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上，用脱脂牛奶常温封闭2 h。用封闭液稀释一抗 (羊抗人RKIP抗体1∶200稀释，鼠抗人β-actin 1∶6 000稀释)，用稀释的一抗常温温育蛋白2 h；TBST缓冲液洗膜；二抗室温温育1 h；缓冲液洗膜3次，每次8 min；ECL试剂显影和曝光检测RKIP蛋白表达。采集图像后使用Quantity One系统分析灰度值，比较RKIP蛋白表达差异。

1.2.3MTT法检测细胞的增殖能力 将Caski-asRKIP、Caski-(-)和未转染的Caski细胞接种于96孔板上，每孔细胞(3～8)×103个，每组5个复孔。分别于培养12、24、36、48、60和72 h后，分别加入20 μL MTT溶液，培养4 h。倒掉培养液，分别加入 DMSO溶解。然后，测定各孔细胞的吸光度(A)值，计算各时间点的平均值，绘制生长曲线。重复实验3次。

1.2.4软琼脂集落形成实验 将7 g/L琼脂糖溶液与2×DMEM培养基混合加入直径6 cm的培养皿中，室温凝固备用(底层琼脂)，然后制备含(1～3)×107/L细胞的顶层琼脂，将顶层琼脂铺至底层琼脂上，于室温下凝固；然后将培养皿放入CO2培养箱中培养2周。显微镜下观察克隆团，计数含多于60个细胞的克隆团,计算克隆形成的平均值,检测宫颈癌细胞体外非依赖性生长的能力。

1.2.5Transwell小室实验检测宫颈癌细胞体外侵袭能力 将预冷好细胞小室的滤膜上面涂趋化剂纤连蛋白，自然风干；将经过DMEM培养液稀释的人工基底膜凝胶作用在滤膜上0.05 h，然后用PBS缓冲液冲洗；在24孔培养板中加入无血清的DMEM培养液(含1 g/L的血清清蛋白)，每孔加入600 μL；用DMEM培养液将Caski-asRKIP#1细胞、Caski-asRKIP#2细胞、Caski-(-)细胞及Caski细胞配制成细胞悬液(密度为2×109/L)，每个小室内加入100 μL细胞悬液；将小室放到条件培养基中培养10 h左右，用缓冲液冲洗3～4次，中性甲醛溶液作用10 min，固定后经苏木精-伊红染色，用刀片取下滤膜固定于载玻片上，显微镜下观察视野中穿过滤膜的细胞。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行数据处理，多组数据比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 构建稳定转染的宫颈癌细胞系

在Caski-asRKIP#1细胞和Caski-asRKIP#2细胞中RKIP的表达水平明显低于Caski-(-)细胞和Caski细胞(图1)，成功地建立了RKIP表达下调的稳定转染的宫颈癌Caski细胞。

2.2 宫颈癌细胞的体外增殖能力

Caski-asRKIP#1和Caski-asRKIP#2细胞的增殖速度均较Caski-(-)细胞和Caski细胞快，差异有统计学意义(t=4.98～6.43，P<0.05)，而Caski细胞和Caski-(-)细胞的增殖速度比较，差异无显著性(t=1.36,P>0.05)。见图2。

图1 各组Caski细胞中RKIP的表达

图2 各组Caski细胞的体外增殖能力

2.3 宫颈癌细胞的体外非依赖性生长

各组Caski细胞均可以在双层琼脂中增殖并形成集落，Caski-asRKIP#1细胞形成集落数为(180±10)个，Caski-asRKIP#2细胞形成集落数为(185±10)个，空白质粒转染的Caski-(-)细胞形成集落数为(90±10)个，未转染的Caski细胞形成集落数为(70±10)个。Caski-asRKIP#1和Caski-asRKIP#2细胞与Caski-(-)细胞、Caski细胞比较，形成的集落大且集落数目多，差异有显著性(F=19.98，P<0.05)；Caski-(-)细胞和Caski细胞比较，差异无显著性(P>0.05)。

2.4 各组宫颈癌细胞的体外侵袭能力比较

各组宫颈癌细胞的侵袭能力不同，其中Caski-asRKIP#1组穿过小室的细胞数为(220±10)个，Caski-asRKIP#2组为(210±10)个，两组比较差异无显著性(t=1.26,P>0.05)；Caski组细胞穿过侵袭小室膜的数目为(160±10)个，Caski-(-)细胞穿膜数目为(175±10)个,两组穿过小室的细胞数比较，差异无统计学意义(t=1.35,P>0.05)。Caski-asRKIP#1组和Caski-asRKIP#2组与Caski-(-)组、Caski组相比较，差异有统计学意义(F=19.98，P<0.05)。

3 讨 论

Raf激酶抑制蛋白属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，是一种从牛脑组织中纯化的胞浆蛋白，在脂代谢和磷脂膜生物合成等方面均可发挥作用，故命名为PRBP-1。1999年有研究结果显示，此基因可以与Raf-1结合，特异性地抑制特定蛋白信号通路，将其称为RKIP[2-3]。后来的研究结果显示，RKIP还同时参与了对NF-κB信号通路及G蛋白偶联受体信号通路的调控[3]。近年来研究结果显示，RKIP表达异常或其信号通路异常与多种恶性疾病密切相关，如前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、乳癌、肝癌、鼻咽癌[4-9]，RKIP表达水平下调与恶性肿瘤的转移有着密切关系。LI等[10-11]研究结果显示，RKIP在妇科恶性肿瘤如卵巢癌、子宫内膜癌组织中的表达下调，一定程度上可促进妇科恶性肿瘤的转移。关于原癌基因与妇科肿瘤的研究比较常见[12]，但是目前国内外关于RKIP等抑癌基因与宫颈癌转移关系的研究报道相对较少。

吴景丽等[13]采用免疫组化方法，对宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织的RKIP表达水平进行了检测，结果显示，宫颈癌组织中的RKIP表达水平低于宫颈上皮内瘤变组织及正常宫颈组织；RKIP在宫颈癌组织中的表达水平与临床分期、有无淋巴结转移及肿瘤分化程度相关。孟琴等[14]研究结果与其相同。但上述研究均采用免疫组织化学方法并且属于回顾性分析，研究结果可信度较低。

本研究采用脂质体法，将含有人全长RKIP基因的反义质粒asRKIP及空白质粒pcDNA3.1(-)分别转入人宫颈癌细胞系Caski细胞中，并用G418筛选出稳定转染的宫颈癌细胞，然后应用Western Blotting方法检测Caski细胞中RKIP的蛋白表达水平，采用MTT法、软琼脂集落形成实验和Transwell小室体外侵袭实验检测RKIP表达下调对宫颈癌细胞增殖的影响。结果显示，反义质粒转染Caski细胞的增殖速度比空白质粒转染Caski细胞和未转染Caski细胞快，差异有显著性；而空白质粒转染Caski细胞与未转染Caski细胞的增殖速度无明显差异，证实转染后RKIP表达下调的宫颈癌细胞体外增殖速度快，即RKIP表达下调可促进宫颈癌细胞的增殖。各组细胞均能在软琼脂中形成集落，反义质粒转染Caski细胞与空白质粒转染Caski

细胞和未转染Caski细胞比较，形成的集落大且数量多，差异有统计学意义，证明RKIP表达下调可以促进Caski细胞的体外非依赖性生长。在Transwell小室实验中，反义质粒转染Caski细胞穿过细胞小室数目比空白质粒转染Caski细胞和未转染Caski细胞多，差异有统计学意义，证实RKIP的表达下调对于宫颈癌细胞的体外侵袭能力有一定程度的影响。本研究结果证实了RKIP表达下调可以促进宫颈癌细胞的增殖，为寻找抗肿瘤效果更强并对人体毒性作用更小的新药物，改善宫颈癌病人的预后提供了新的参考。

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