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(青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 266021)

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，而在临床上80%～90%的肝癌病例为肝细胞性肝癌(HCC)。HCC的发生是一个多因素、多阶段的复杂过程，其发病的分子机制尚不清楚。研究表明，HCC的发生不仅与基因突变有关，抑癌基因启动子区CpG序列异常甲基化导致的基因失活也是肝癌发生的一个重要途径[1-3]。多肿瘤抑制因子p16和结肠腺瘤样息肉基因(APC)是两个重要的肿瘤抑制基因，其中p16基因是细胞周期的负调控因子[1]，APC基因可控制细胞分裂过程中起关键作用的基因的表达[4]。已有研究结果显示，肝癌、胃癌等多种肿瘤组织及血浆标本中p16、APC基因的启动子区域CpG岛常发生异常甲基化[2,5-6]，但不同研究者报道的p16、APC基因甲基化在肝癌组织及血浆标本的检出率有一定差异，特别是基因甲基化在癌组织与对应血浆标本表达的情况存在较大差异。本研究采用实时荧光PCR技术测定86例病人HCC组织及相应癌旁正常组织、血浆中p16、APC基因启动子区CpG岛甲基化情况，分析p16、APC基因甲基化在癌组织与血浆标本检出情况及其与HCC病人临床特征关系，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2008年6月—2009年6月于青岛大学医学院附属医院行外科切除术的HCC病人标本86例，男69例，女17例；以24例正常人及良性肝病病人正常肝组织作为对照。全部病例均经组织病理学检查证实，根据国际抗癌联盟(UICC)分期标准对HCC进行分期。

1.2 标本的获取

术前采集受检者外周静脉血5 mL，2 h内离心分别取血浆和血细胞置于1.5 mL塑料离心管中；病人手术时收集HCC组织及相应的癌旁正常组织(取自距癌灶边缘3～5 cm外观正常的组织，均避开坏死、炎症部位，编号与外周血标本对应)标本。所有标本获取经青岛大学医学院附属医院伦理委员会批准，病人或家属知情同意。

1.3 肝癌组织、癌旁正常组织和血浆标本DNA的抽提

使用组织基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)按照试剂盒说明，进行组织DNA的抽提；采用酚氯仿法进行外周血标本DNA的抽提。

1.4 p16、APC甲基化检测

1.4.1DNA修饰 取15 μL DNA，加入5 μL M-2Dilution Buffer混匀，去离子水补足50 μL，37 ℃水浴15 min。根据试剂盒说明的要求，将DNA进行亚硫酸氢钠修饰及纯化，最终溶于40 μL TE溶液,-20 ℃保存。

1.4.2PCR检测p16、APC甲基化状态 引物序列见表1。PCR扩增反应体系10 μL：包括亚硫酸氢钠修饰的模板1 μL(25 ng)，200 nmol/L的引物各0.5 μL， 2× Epitect HRM Master Mix(HotStarTaq 酶、DNA 聚合酶、EpiTect HRM PCR Buffer)5 μL，以去离子水补足至10 μL。扩增条件：95 ℃预变性 20 s，然后以适宜的温度退火30 s，72 ℃退火40 s、95 ℃退火1 min，进行50个循环，再95 ℃延伸1 min，最后20 ℃终止反应。PCR 扩增结束后，在PCR仪上直接进行高分辨熔解。对PCR产物以0.2 ℃/s的速度行55～90 ℃熔解曲线分析，通过分析熔解曲线直接判定甲基化情况。

1.5 统计分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，癌组织、癌旁正常组织和对应血浆之间甲基化率比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 p16和APC基因甲基化情况比较

本文24例正常肝组织未检出p16和APC基因的异常甲基化。癌组织p16基因甲基化率明显高于癌旁正常组织和对应的血浆标本(χ2=67.48、6.72，P<0.05)。癌组织中APC基因甲基化率也均明显高于癌旁正常组织和对应的血浆标本(χ2=18.03、29.16，P<0.05)。肝癌组织及对应血浆标本p16、APC基因甲基化的一致率分别为65.4%、43.3%。见表2。

表1 甲基化特异性引物序列

表2 癌组织、癌旁组织及血浆标本中基因甲基化率的比较(例(χ%))

2.2 癌组织及对应血浆标本基因甲基化率与临床特征的关系

癌组织及对应血浆标本p16和APC基因甲基化率与病人年龄、性别、吸烟状况、饮酒状况、TNM分期、肿瘤大小以及甲胎蛋白(AFP)水平无相关性(P>0.05)。HBsAg阳性组病人肝癌组织及对应血浆标本p16基因甲基化率显著高于HBsAg阴性组(χ2=5.60、5.67，P<0.05)。见表3。

3 讨 论

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，在调节基因表达及维持细胞正常分化中起着重要作用，并与肿瘤的发生发展密切相关[7]。已有研究结果显示，人类肿瘤组织和肿瘤细胞中众多癌相关基因启动子区CpG岛存在高甲基化现象，如抑癌基因、肿瘤转移抑制基因、DNA修复基因等[1,4,7]。

p16和APC基因是两个重要的多肿瘤抑制基因，其中p16基因产物是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制因子[1]，APC基因产物是Wnt信号传导途径的重要组成部分，可控制细胞分裂过程中起关键作用的基因的表达[4]。目前，国内外已有大量有关p16和APC基因在肿瘤组织及血浆中异常甲基化检测的研究报道，但结果仍存在一定差异。LOU等[8]研究结果显示，肝癌组织p16基因启动子区甲基化频率显著高于癌旁组织，而蒋磊等[9]研究结果则显示，肝癌组织中p16基因异常甲基化率仅为30%(12/40)。同样吴龙等[10]的研究结果显示，肝癌组织APC基因甲基化率显著高于癌旁及正常对照肝组织，认为是APC基因甲基化参与了肝癌的形成。而YU等[11]报道，在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中均未检测到APC基因甲基化，进而推测APC基因甲基化可能在肝癌形成过程中不发挥作用。不同研究者结论不一致的原因可能与研究对象的例数、甲基化的检测方法不同等有关。本研究结果显示，86例HCC组织p16和APC基因的甲基化频率显著高于相应癌旁组织和血浆标本，且差异有显著性，这与LOU等[8]和吴龙等[10]的研究结果一致，提示抑癌基因甲基化可能是肝癌发生、发展的一个重要因素。

表3 肝癌病人p16、APC启动子区甲基化与临床特征的关系(例(χ%))

肝癌的发生是一个多因素、多步骤的过程，与多种致病因素有关，因此我们分析了癌组织与对应血浆标本中p16、APC基因甲基化状态与年龄、性别、HBV感染、TNM分期、肿瘤大小等临床特征的关系，结果显示，HBsAg阳性者肝癌组织及其对应血浆p16基因启动子区甲基化频率分别为66.2%和46.5%，显著高于HBsAg阴性者，提示基因甲基化与HBV感染关系密切，其可能是导致HCC发生的一个重要因素[12]。另外，本研究结果还显示，p16、APC基因甲基化状态与TNM分期、肿瘤大小无关，提示两种基因的失活可能均发生于癌变的初始阶段。

由于癌组织的检测在取材和检测等方面存在操作不方便、难度较大、易给病人造成痛苦和创伤等问题，所以本研究同时检测了血浆中p16、APC基因启动子区的甲基化状态。结果显示，癌组织和血浆标本p16基因启动子区甲基化的一致率为65.4%，血浆p16基因启动子区甲基化频率显著高于癌旁组织，提示检测血浆p16基因启动子区甲基化在肝癌早期诊断方面可能具有辅助价值。然而，血浆标本中APC基因启动子区甲基化频率与癌旁正常组织差异无显著性，其在肝癌早期诊断方面能否作为非侵入性肿瘤诊断辅助方法有待进一步研究。

总之，肝癌组织中p16、APC基因处于高甲基化状态，此种状态可能是肝癌发生过程中一个重要因素。研究肝癌病人特异性基因甲基化的状态，有助于我们更深入地认识基因甲基化在肝癌发生发展中所起的作用，为肝癌的预防、早期诊断及治疗提供科学的理论依据。

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