任晓芬，潘道东，曹锦轩，曾小群

（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

据专家预测，20年后全世界将会有超过15亿人罹患高血压，罹患人数比2000年增加60%。中国作为世界上高血压危害最严重的国家之一，最近几年全国每年新增六百多万名高血压患者。目前治疗高血压的药物大多数是化学合成的ACE抑制剂类药物，长期服用降压药将会严重地损害心、脑、肝、肾等重要的人体器官，并加剧并发症的发生，最终危及人的生命。而通过摄入食源性ACE抑制物质，不仅可以达到预防、控制和缓解高血压的效果，而且相对于合成的降压药更安全可靠且无副作用，因此对于食源性ACE抑制物质的研究必然成为今后的发展趋势。近年来，研究发现一些乳酸菌制作的发酵乳制品具有较强的降高血压功能，主要是由于乳酸菌在发酵过程中分泌的蛋白酶水解乳蛋白产生多肽，对血管紧张素转移酶（angiotensin I-converting enzyme）具有抑制作用，从而达到降血压的效果[1-3]。而酪蛋白作为乳蛋白的主要组成部分，可以通过酪蛋白水解产生ACE抑制肽，如Jeanette Otte等[4]从β-酪蛋白的水解物中分离鉴定出三种ACE抑制肽，它们分别源于β-酪蛋白A2的f58-76、f59-76及f192-196片段；潘道东等[5]从Lactobacillus helveticus JCM 1004酪蛋白水解产物中分离纯化出Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro两种ACE抑制肽。胞壁蛋白酶（Cell-envelope Proteinase，CEP）作为乳酸菌蛋白水解系统中一种重要的酶，遇到乳蛋白时[6]，首先将乳蛋白水解为一系列的短肽，再由寡肽转移系统（Opp）、二肽和三肽转运系统（DtpP和DtpT）运输至细胞内，最后由胞内肽酶（包括氨肽酶、肽链内切酶、pro-特异性肽酶等）将短肽进一步水解成具有降血压作用的ACE抑制肽。由于ACE抑制肽是在蛋白水解过程中产生，但是其具体的水解机制尚不成熟，因此对于CEP的研究就至关重要。根据不同的菌体特性所选择的破壁方法也不同，目前可用于提取CEP的方法主要有3种[7-9]：Ca2+-free法、溶菌酶法和超声波破碎法。由于采用Ca2+-free法提取出的蛋白酶只是暴露在细胞壁外的N-端序列，因此提取率不高[8]；而超声波破碎法由于其功率不稳定、破碎强度较大，且会带入大量的胞内酶，因此不利于后期的分离纯化。本实验采用溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取CEP，并对粗提物进行分离纯化，不仅具有方法简便、实验条件易控制、提取率高等优点，而且可以为研究乳酸菌蛋白酶水解机制建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜酸乳杆菌JQ-1 实验室筛选保藏菌株；溶菌酶 北京普博欣生物科技有限责任公司；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg） 上海生工生物工程公司；考马斯亮蓝G-250 南京赛吉科技有限公司；聚乙二醇（PEG）-20000 国药集团化学试剂有限公司；DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-100 上海博蕴生物科技有限公司；马尿酰-组氨酸-亮氨酸（Hippuryl-l-histidyl-l-leucine，HHL）、血管紧张素转化酶（ACE）、β-酪蛋白 Sigma公司；MRS培养基。

可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；恒温恒湿培养箱 宁波江南仪器厂；H 2500R-2型湘仪离心机、H-2050R型台式高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；分离层析装置 上海沪西分析仪器厂有限公司；垂直电泳仪 北京市六一仪器厂；DB-2型电热板 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体的制备 嗜酸乳杆菌菌体JQ-1采用50%甘油保藏（-40℃冷藏），连续活化三代，取3%接种量至新配制的MRS培养基中，37℃下扩大培养16h后取出，离心收集菌体沉淀（4500r/min，20min，4℃）。用含有Ca2+（30mmol/L）的Tris-HCl（50mmol/L，pH7.8）缓冲液洗涤菌体，于4500r/min，4℃下离心20min，弃上清液，重复洗涤三次，收集菌体，冷冻干燥后备用。

1.2.2 胞壁蛋白酶提取 取菌体2g，用裂解液（2mmol/L EDTA-Na2、100mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl、体积分数0.5%Triton X-100、1mg/mL溶菌酶，pH8.5）40mL悬浮菌体，37℃下保温3h，于4℃、4500r/min离心20min，所得上清液即为粗酶液。根据温度、时间及菌粉与裂解液比例单因素实验结果，选取适当条件进行正交实验设计L9（34）优化。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test table L9（34）

1.2.3 CEP酶活力测定[10]取20μL底物MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg）（16.4mmol/L），40μL酶液，1.14mL Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH7.0）混合，在37℃保温60min。用0.5mL乙酸（体积分数30%）终止反应，在410nm处测定吸光度（测定时需补充2.3mL蒸馏水）。空白对照组，以蒸馏水代替酶液同样条件操作。

酶活力单位定义：37℃，每小时A410nm增加0.10定义为一个酶活力单位（U/mL）。

酶比活力（U/mg）=酶活力/蛋白含量

1.2.4 蛋白含量测定[11]取1mL样品、5mL蛋白试剂（将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%的乙醇中，再加入100mL 85%的磷酸，用双蒸水补至1000mL），充分振荡均匀，2min后于595nm波长处测定吸光度值，以双蒸水作为空白对照组。以牛血清蛋白作为测定蛋白含量的标准样品。

1.2.5 ACE抑制活性检测方法[12]取200μL Hip-His-Leu（6.7mmol/L）溶液和100μL的样品（即蛋白酶CEP水解β-酪蛋白的产物）混合，于37℃下保温3min。再加入20μL ACE（0.1U/mL）溶液，充分混匀后在37℃下保温30min。加入250μL的1.0N盐酸溶液使反应终止，然后加入1.7mL醋酸乙酯，经15s振荡混匀，吸取1.0mL的醋酸乙酯层于小烧杯中，置100℃的恒温加热板上蒸干。将其重新溶于1mL的去离子水中，在228nm波长处测定吸光度值。

式中，A为含样品时，ACE和底物H-H-L反应的吸光度值；B为用蒸馏水代替样品时，ACE和底物HH-L反应的吸光度值，即对照组。

1.2.6 嗜酸乳杆菌胞壁蛋白粗酶液浓缩 采用聚乙二醇浓缩法，将粗酶液装入半透膜的袋里，截留分子量为3400u，外加聚乙二醇-20000覆盖，并置于温度为4℃的冰箱中，待浓缩至一定体积后取出。

1.2.7 DEAE-Sephadex A-25层析 DEAE-Sephadex A-25填料经预处理后装柱（φ2.6cm×40cm），用50mmol/L Tris-HCl（pH7.0）缓冲液充分平衡，上样量为3mL，流速为40mL/h，采用50mmol/L Tris-HCl（pH7.0），0～0.1mol/L NaCl洗脱液进行线性梯度洗脱，收集A280nm处的洗脱峰测定酶活力及蛋白含量。收集酶活最高的洗脱峰以备下一步层析用。

1.2.8 Sephadex G-100层析 Sephadex G-100填料经预处理后装柱（φ1.6cm×50cm），用50mmol/L Tris-HCl（pH8.3）缓冲液充分平衡，上样量为2mL，流速为20mL/h，采用50mmol/L Tris-HCl（pH8.3）洗脱液进行洗脱，收集A280nm处的洗脱峰测定酶活力及蛋白含量。

1.2.9 回收率及提纯倍数计算 在酶的分离纯化过程中，每完成一个关键的实验步骤，均需测定酶的总活力及比活力，以监视酶的去向。通过总活力的回收率及酶的提纯倍数可判断分离纯化方法的优劣及提纯效果。

回收率（%）=（纯化后的酶活力/粗酶液的酶活力）×100

纯化倍数=纯化后的酶比活力/粗酶液的酶比活力

1.2.10 蛋白酶分子量鉴定 蛋白酶分子量测定采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[13-14]。

2 结果与分析

2.1 CEP提取条件的优化

2.1.1 菌体与裂解液比例的确定 由图1可知，在菌体与裂解液比例为1∶10（g/mL）时，CEP的酶活、酶比活最高，之后随着菌体与裂解液比例的增大，CEP的酶活、酶比活均逐渐降低。溶菌酶作为裂解液中的关键成分，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。随着菌体与裂解液比例的增大，体系中的溶菌酶过多，可能发生结合，反而降低了裂解效果，使酶活、酶比活随之降低。

图1 菌体与裂解液的比例对CEP提取的影响Fig.1 Effect of thallus/cell lysis solution ratio on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.2 保温时间的确定 由图2可知，随着保温时间的增加，CEP蛋白酶活和蛋白酶比活均逐渐增大；当保温时间至3.5h时，酶活、酶比活力均达到最大值；随着保温时间的继续增加，蛋白酶活、酶比活反而逐渐下降。这是由于当时间小于3.5h时，裂解液尚未完全破坏菌体细胞壁，所以酶活逐渐上升；当时间超过3.5h时，由于随着乳酸发酵的进行，蛋白酶的作用加剧，提高了嗜酸乳杆菌蛋白酶对蛋白质的分解能力[15]，底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强，因此酶活降低。

图2 保温时间对CEP提取的影响Fig.2 Effect of incubation time on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.3 保温温度的确定 由图3可知，随着温度的上升，酶活力和酶比活力都呈增大趋势，当保温温度为37℃时，酶活力和酶比活力都达到最大值，随后酶活力和酶比活都会随着温度的上升而逐渐下降。这是由于低温、高温都偏离酶的最适温度，低温会降低酶反应的速度，而高温不仅会降低酶反应的速度，甚至会使酶失活，因此低温、高温均不利于酶的提取。

图3 保温温度对CEP提取的影响Fig.3 Effect of incubation temperature on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.4 提取条件正交实验的优化 在单因素实验结果基础上，确定了提取条件正交实验的几种考察因素及水平，以酶比活力（酶比活力=酶活力/蛋白含量）为指标，结果见表2。

表2 提取条件正交实验结果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing three extraction conditions

从表3的极差可以看出，A、B、C三个因素中，A因素对酶比活力的影响是最显著的，且各个因素影响CEP提取的大小顺序为：菌体与裂解液的比例＞保温时间＞保温温度，这反映出菌体与裂解液比例是CEP提取最关键的一个因素，保温时间、保温温度两因素的影响相对小一些。通过极差分析得出酶活力最优水平组合是A1B3C1，而9个实验组中最佳组合为A1B1C1，经验证实验可得，A1B3C1条件下酶比活可达11.629U/mg，效果更好。因此可确定嗜酸乳杆菌CEP的最佳提取条件为：菌体与裂解液的比例1∶5（g/mL）、保温温度33℃、保温时间4.0h，在该条件下所得酶比活力为11.629U/mg。

表3 提取条件优化的正交实验的极差分析结果Table 3 Analysis of orthogonal test of optimizing three extraction conditions

2.2 DEAE-Sephadex A-25离子交换层析

将粗酶液用聚乙二醇-20000浓缩，取浓缩酶液3mL上样。经DEAE-Sephadex A-25离子交换层析后有六个组分，收集每个组分测其蛋白酶活性（表4，图4），发现第一组分蛋白酶活性最高，SDS-PAGE电泳检测第一组分为一条带（图5）。

表4 DEAE Sephadex A-25各洗脱峰酶活分布Table 4 The activity of CEP of DEAE Sephadex A-25

图4 DEAE-Sephadex A-25离子交换层析图谱Fig.4 DEAE-Sephadex A-25 chromatography of crude CEP obtained by ammonium sulfate precipitation

2.3 Sephadex G-100层析

收集DEAE-Sephadex A-25第一组分，经聚乙二醇-20000浓缩后上样，上样量为2mL，发现Sephadex G-100层析后只有一个组分（图5），检测该组分蛋白酶活力为9.069U。SDS-PAGE电泳检测为一条带（图5），且与DEAE-Sephadex A-25第一组分的电泳条带一致。经SDS-PAGE电泳测定CEP为单体结构，分子量约为45ku。蛋白酶经Sephadex G-100纯化后，比活力达到27.055U/mg，提纯倍数达到50.951倍，最后回收率为12.569%（表5）。

图5 细胞壁蛋白酶的SDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PAGE of CEP

表5 胞壁蛋白酶纯化过程Table 5 Data of purification procedure of CEP

2.4 ACE抑制活性检测

将β-酪蛋白用50mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液配成2mg/mL的溶液，分别200μL作为底物，加入2mg/mL纯化后CEP 40μL，于37℃中保温4h，在100℃中加热5min灭酶，经测定发现水解液具有ACE抑制活性，且ACE抑制活性达48%。

图6 Sephadex G-100层析图谱Fig.6 Sephadex G-100 chromatography of fraction 1 obtained from DEAE-Sephadex A-25 chromatography

3 结论

本实验确定了溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取嗜酸乳杆菌JQ-1中CEP的最佳条件：菌体与裂解液比例为1∶5（g/mL），33℃下保温4.0h，于4℃、4500r/min离心20min后取上清液即为粗酶液。此法简便，实验条件易控制，酶活力也较高。粗酶液经聚乙二醇-20000浓缩，DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100两步柱层析分离纯化后，蛋白酶提纯倍数达50.951倍，最后回收率为12.569%。且SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构，分子量大约为45ku。用纯化后的CEP水解β-酪蛋白，水解液ACE抑制率达48%。由此说明，胞壁蛋白酶在嗜酸乳杆菌水解酪蛋白产生ACE抑制肽过程中起关键作用，但是其水解机制还有待于进一步研究。

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