张 朝，李永生，*，高秀峰

（1.四川大学化工学院，四川成都610065；2.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041）

POD（Peroxidase，EC1.11.1.7）是一类以血红素为辅基的氧化还原酶，主要催化H2O2或其他过氧化物与酚类、胺类物质的反应[1]，广泛存在于各种动物、植物、微生物体内[2]。POD早期常作为标记物用于医学诊断、酶联免疫反应[3]；近年来其应用范围扩展到食品的保鲜、工业“三废”的处理、有机物和高分子的合成、木质素的降解、生物传感器的制作、农业废弃物的处理等领域[4]；目前广泛使用的POD（辣根POD、大豆POD）产量低、价格昂贵，成为制约其应用的主要因素。植物来源的POD有着原材料廉价易得、易于纯化、稳定性好的优点，研究人员已对辣根[5]、荔枝果皮[6]、大豆[7]、莲藕[8]、茭白[9]、甘薯叶[10]等植物样品的POD进行了分离纯化和性质研究。但是，从植物中筛选出一种富含POD的样品，以期在大规模工业生产中提高POD产量，迄今国内尚未见该方面的报道。本研究拟利用RCFA法测定多种植物样品中POD的含量，找到一种POD含量较高的植物样品，并对其POD进行纯化和酶学性质研究，为POD的大规模生产及应用提供参考和理论依据。同时，这也是首次关于沙田柚皮过氧化物酶（SPP）的研究和报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙田柚 购于四川成都华联超市；Sephadex G-200 Whatman公司；H2O2成都金山化工试剂厂，分析纯；GA 中国上海佘山化工厂，化学纯；硫酸铵 广东汕头市西陇化工厂，分析纯；考马斯亮蓝G250 上海化学试剂公司，分析纯；牛血清蛋白 Sigma公司，优级纯；磷酸、无水乙醇 成都科龙化工有限公司，分析纯；磷酸氢二钠 重庆北培化学试剂厂，分析纯；磷酸二氢钠 天津市化学试剂六厂，分析纯。

721型分光光度计 配有流通池（光程为10mm，内径1.5mm），上海第三分析仪器厂；蠕动泵 东北电力学院仪器仪表厂；GL-150型微型恒温控制器 苏州江东精密仪器有限公司；AUW型电子天平、流通式紫外-可见分光光度计 日本岛津株式会社；pH计 日本东亚电波工业株式会社；XWT-S小型台式记录仪 上海自动化仪表三厂；高速台式冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量的测定方法 蛋白质含量测定采用Bradford染色法，以牛血清蛋白为标准蛋白质[11]。

1.2.2 植物样品及沙田柚皮粗酶液的制备 用于植物样品POD活性测定的粗酶液均采用研磨法[12]制备，过程如下：称取适量新鲜植物样品，剪碎后放置于研钵中，加入样品质量20%的玻璃微珠及5mL 0.05mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.6）研磨至糊状，在4000r/min下离心45min，过滤后取上清液并定容至10mL。

用于纯化的SPP粗酶液采用匀浆法[13]制备。操作如下：称取适量新鲜沙田柚皮置于匀浆器中，按料液比1∶5的比例加入0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6）；用匀浆器处理10min后，冷却、抽滤，将滤液反复冻融后即得SPP粗酶液（Ⅰ）。

1.2.3 SPP的分离纯化过程 取15mL粗酶液（Ⅰ），加固体硫酸铵分级沉淀[14]，收集饱和度为40%～100%内的沉淀，沉淀溶于1.5mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6）中，得酶液（Ⅱ）。将酶液（Ⅱ）上样于Sephadex G-200凝胶层析柱（1cm×20cm）[6]，上样体积为1mL。用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6）以流速1mL/min洗脱，洗脱液最后经过流通式紫外-可见分光光度计，在280nm波长下监测蛋白含量变化，收集各蛋白峰对应的洗脱液。测定各收集液的酶活性和蛋白浓度[15-16]，得到纯化后的酶液（Ⅲ）。

1.2.4 RCFA法测定过程 以RCFA法[17-18]测定POD活性浓度，测定过程如下：在反应池中加入0.50mL 0.50mmol/L H2O2与0.50mL 1.56mmol/L GA溶液，混匀后预热至37℃[19]；使用0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.6）彻底冲洗流路至吸光度零值，RCFA系统中存留缓冲液为1.0mL；将系统的入口和出口插入反应池后，开启蠕动泵，使混合液循环至吸光度达到稳定；然后在反应池中加入酶液20μL（由于V酶液/V混合液〈1%，加入酶液所导致的溶液稀释可忽略）开始进行酶催化反应，反应混合液被泵连续不断地抽进检测器进行循环，由记录仪得到一条产物吸光度值随时间变化的反应动力学曲线，根据动力学曲线法计算酶活性浓度。酶活性的定义：在测定条件下，吸光度值每分钟增加0.01所需要的酶量，定义为一个活力单位（U）。

1.3 鲜重比活力和比活力的计算

鲜重比活力为总酶活与所取样品鲜重的比值，U/mg，见式（1）。

鲜重比活力=酶液总酶活/样品鲜重 式（1）

比活力根据国际酶学委员会规定用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示，U/mg，见式（2）。

比活力=酶液总酶活/酶液总蛋含量 式（2）

2 结果与分析

2.1 植物样品鲜重比活力的比较

实验共测定了15种植物样品，见表1，它们的鲜重比活力为1.10×10-4～1.51×10-2U/mg。柚皮类的样品鲜重比活力普遍较高，沙田柚皮（1.51×10-2U/mg）的鲜重比活力是红薯（1.20×10-3U/mg，鲜重比活力仅次于柚皮类）的12.56倍。由此可见，沙田柚皮的POD含量极高，是一种制备POD的理想原材料。

表1 各种植物样品中鲜重比活力Table 1 Specific activity with fresh weight of various plant samples

2.2 SPP的分离纯化

洗脱曲线如图1所示，洗脱过程中共出现四个蛋白峰，通过测定收集液的酶活性表明，SPP仅存在于第一个蛋白峰收集液（活性浓度为2925U/L），之后的三个蛋白峰收集液均无SPP酶活性（活性浓度为0）。纯化结果见表2，盐析过程的纯化倍数为4.49倍，产率为73.93%；再经Sephadex G-200凝胶柱层析，纯化倍数达到26.22倍，产率为43.20%。经过两步纯化，SPP的比活力从11.95U/mg提高至313.29U/mg。由此可见，该过程达到了纯化SPP的目的，且产率良好。

表2 SPP纯化效果评价Table 2 Effect of the purification of SPP

图1 葡聚糖G-200柱层析结果Fig.1 Sephadex G-200 column gel filtration of SPP

2.3 SPP最适温度及温度稳定性的考察

分别测定不同温度（35～80℃）下酶液（Ⅲ）的活性。以最适温度下的酶活性为100%，其余温度下的酶活性分别与之相比得相对酶活性。图2是不同温度下的相对酶活性曲线，在温度为55℃时达到峰值，表明SPP的最适温度为55℃。在35～55℃时，相对酶活性随着温度的升高而升高，温度对SPP的活性表现出促进作用，这是由于温度升高使底物活化分子增多，反应速率加快；在55～80℃时，相对酶活性随着温度的升高而下降，温度对SPP的活性体现抑制作用，是由于高温使酶蛋白变性。

图2 温度对沙田柚皮过氧化物酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on SPP activity

将酶液（Ⅲ）在不同温度（4～85℃）下保存1h[7]，迅速冷却后分别测定其剩余酶活性。以4℃下酶活性为100%，其余温度下的酶活性分别与之相比得剩余酶活性，见图3。温度大于55℃时，酶活性迅速下降；在4～55℃时，酶活性基本不变（剩余酶活性＞91.7%）；故SPP具有良好的热稳定性，温度适用范围广。

2.4 SPP最适pH及pH稳定性的考察

分别测定不同pH（4.5～10.0）下酶液（Ⅲ）的活性，以最适pH下的酶活性为100%，其余pH下的酶活性分别与之相比得相对酶活性，见图4。从图4中可以看出，pH为5.5时，曲线达到峰顶，表明SPP的最适pH为5.5。pH为4.5～5.5时，酶活性随着pH的升高而升高，其原因是pH的改变影响了酶蛋白的解离状态[20]，在此pH范围内，pH越大，SPP的解离状态越具有催化效率。pH为5.5～10时，酶活性随着pH升高而降低，这是因为pH继续升高，SPP的解离状态朝着失去酶活性的方向变化。

图4 pH对沙田柚皮过氧化物酶活性的影响Fig.4 Effect of pH values on SPP activity

图5 pH对沙田柚皮过氧化物酶稳定性的影响Fig.5 Effect of pH values on the stability of SPP

将酶液（Ⅲ）在不同pH（2.0～12.0）的磷酸盐缓冲液（0.05mol/L）中4℃下保存24h[21]后，分别测定其剩余酶活性；以酶液在各pH条件下不经保存直接测定得到的酶活性为100%，保存24h后的酶活性分别与之相比得相对酶活性。pH为2和12时，测得保存24h后的酶活性为0，故相对酶活性也为0；其余条件下的相对酶活性见图5。从图5中可以看出，pH为7.5～8.0时，SPP活性稳定。pH为5和10时，剩余酶活性分别为49.4%和50.5%，仅损失一半活性，说明SPP具有较广的pH适用范围，酸碱耐受性强。

2.5 SPP酶动力学研究

在最适条件下，测定不同H2O2浓度（0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mmol/L）下酶液（Ⅲ）的酶促反应速率△A/△t，结果见图6。从图6中可以看出，当H2O2浓度小于0.6mmol/L时，随着H2O2浓度的增加，反应速率呈现上升的趋势，这是由于底物浓度增加，导致反应朝着生成产物的方向移动，反应速率加快；但随着反应体系中底物浓度越来越趋于饱和，底物浓度增加对反应速率的影响也会逐渐减小。以H2O2浓度的倒数为横坐标，对应的反应速率的倒数△t/△A为纵坐标，作Lineweaver-Burk图[22]，见图7，求得关于H2O2的双倒数曲线的线性方程为y=0.1742x+1.7516（R=0.9985），由方程算得以H2O2为底物的Km与Vmax分别为0.099mmol/L、0.569mmol/（L·min）。

图6 反应速率与H2O2浓度关系曲线Fig.6 Relationship between reaction speed and H2O2concentration

图7 以H2O2为底物的Lineweaver-Burk图Fig.7 Lineweaver-Burk plots of SPP with H2O2

同样，测定不同GA浓度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75mmol/L）下酶液（Ⅲ）的酶促反应速率△A/△t，结果见图8。曲线的变化趋势与图6相似，造成这种趋势的原因相同。同样，以GA浓度的倒数为横坐标，对应的反应速率的倒数△t/△A为纵坐标，作Lineweaver-Burk图，见图9，求得关于GA的双倒数曲线的线性方程为y=1.1606x+1.344（R=0.9987），由方程算得以GA为底物的Km与Vmax分别为0.864mmol/L、0.744mmol/（L·min）。

图8 反应速率与GA浓度关系曲线Fig.8 Relationship between reaction speed and GA concentration

图9 以GA为底物的Lineweaver-Burk图Fig.9 Lineweaver-Burk plots of SPP with GA

3 结论

本研究从常见废弃物沙田柚皮中找到了一种尚无研究报道的新型过氧化物酶——SPP，该酶具有含量丰富的显著特点。同时，也填补了关于不同植物中过氧化物酶含量比较研究的空白。

对SPP的纯化，并没有像传统的POD纯化方法那样经过二次沉淀和二到三次层析，而是使用硫酸铵盐析、Sephadex G-200凝胶柱层析两步法即达到了纯化目的；该纯化方法操作简单，大大缩短了纯化周期，既节约了时间也节约了成本，比较适合工业生产。

酶学性质的实验结果表明，SPP具有很广的温度和pH适用范围：最适温度为55℃，55℃以下保存1h几乎不失活；最适pH为5.5，在pH5～10的条件下保存24h仅损失一半活性。

总之，SPP具有含量丰富、易于纯化、温度和pH作用范围广的优点；沙田柚皮是一种常见的生活垃圾，利用其生产高附加值的POD绿色环保、价格低廉，符合绿色化学的发展趋势；因此本研究的应用前景是非常乐观的。

[1]Dunford H B，Stillman J S.On the function and mechanism of peroxidase[J].Coord Chem Rev，1976，19：187-251.

[2]Welinder K G.Superfamily of plant，fungal and bacterial peroxidases[J].Curr Opin Struct Biol，1992，2：388-393.

[3]Winer J A.A review of the status of the horseradish peroxidase method in neuroanatomy[J].Biobehav Rev，1977，1（1）：45-54.

[4]孙立水，高强.过氧化物酶的应用研究进展[J].化工技术与开发，2006，35（12）：13-16.

[5]范军，李纯，稽跃琴，等.辣根过氧化物酶的分离制备和纯化[J].安徽农业大学学报，1998，25（3）：313-316.

[6]宫钦嵚，田世平.荔枝果皮过氧化酶的纯化与性质研究[J].生物化学与生物物理进展，2006，29（6）：891-896.

[7]徐芝勇，严群，强毅，等.大豆过氧化物酶纯化及酶学特性研究[J].中国粮油学报，2006，21（2）：82-83.

[8]瑞琦，张丽丽，郭小路，唐云明.莲藕过氧化物酶的分离纯化及性质研究[J].西南大学学报：自然科学版，2007，29（12）：66-67.

[9]周涛，许时婴，王璋，等.茭白中过氧化物酶的部分纯化及其性质的初步研究[J].食品工业科技，2005，26（7）：81-83.

[10]付伟丽，唐靓婷，王松，等.甘薯叶过氧化物酶的分离纯化及其部分性质研究[J].食品科学，2010，31（7）：223-227.

[11]Bradford M M.A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Biochem，1976，72：248-254.

[12]曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：中国轻工业出版社，2007：101-103.

[13]何平，施伟平，傅雪琳，等.甘蔗苗过氧化物酶的分离、纯化及性质测定[J].上海交通大学学报，2003，21（2）：131-133.

[14]刘均洪，邱龙辉，李俊峰，等.豆壳过氧化物酶的分离纯化新工艺研究[J].化学工程，2005，33（6）：32-34.

[15]曹稳根，焦庆才，刘茜，等.考马斯亮蓝显色剂变色反应机理的研究[J].化学学报，2002，60（9）：1656-1661.

[16]Toyama H，Nishabayashi E，Saeki M，et al.Factors required for the catalytic reaction of PqqC/D which produces pyrroloquinoline quinine[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，354（1）：290-295.

[17]魏然飞，高秀峰，李永生.循环连续流动分析法测定辣根过氧化物酶的活性[J].分析化学，2009，37（6）：897-901.

[18]王恒.测定过氧化物酶活性的循环催化流动分析法的建立及多种植物实样的测定研究[D].成都：四川大学，2010.

[19]张克坚，杨振华.临床酶学标准化的新途径[J].中华医学检验杂志，1999，22（1）：54-55.

[20]Burnette F.Peroxidase and its relationship to food flavor and quality：A review[J].J Food Sci，1977，42：1-6.

[21]刘稳，方靖，高培基.豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究[J].中国生物化学与分子生物学报，1998，14（5）：577-582.

[22]Cleland W W.The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products[J].Biochim Biophys Acta，1963，67：104-137.