彭 松，锁 然，霍 莉，黄 园，范力欣

（1.河北农业大学理学院，河北保定071001；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

枣又称红枣（Fructus jujuba Mill），是中国特有果品，其具有很高的营养和药用价值[1]，部分用于酿造枣酒。枣酒的生产采用固态发酵法，酒的品种以蒸馏酒为主。但由于枣酒中甲醇含量过高限制了其大规模工业化生产。甲醇主要由原料中果胶内甲基酯分解而成[2-3]，是枣酒中甲醇的主要来源。甲醇摄入过量容易引起中毒[4-5]、失明甚至死亡[6-8]。因此关于酒中甲醇含量，国家已颁布相应标准[9]。目前检测不同样品基质中甲醇含量的方法主要有分光光度法[10]、气相色谱法[11-14]等。我国制定GB/T 5009.48-2003《蒸馏酒及配制酒卫生标准的分析方法》，规定了酒中甲醇含量的测定方法[15]。近年来运用气相色谱法测定枣酒中甲醇含量已有相关报道[16-17]，但关于不同酒龄枣酒中甲醇含量的测定还鲜有报道。另外国标采用的填充柱柱效低、分离度差，且与目前多数检测机构配制的高灵敏度和稳定性的气相色谱仪不相匹配。因此本研究采用毛细管气相色谱法，对气相色谱条件进行优化，并对不同厂家生产的不同酒龄枣酒中甲醇含量进行了测定，为进一步研究枣酒中甲醇含量变化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇（色谱纯）、60%乙醇（色谱纯）水溶液 购于Honeywell Burdick&Jackson公司；枣酒酒样 选自保定阜平县5个不同酒厂生产的不同年份的原酒（B厂生产的新酒、2年陈、4年陈、6年陈、8年陈、10年陈、20年陈加曲酒以编号B1、B2、B4、B6、B8、B10、B20表示；C厂生产的2年陈、4年陈加酵母酒以编号C2、C4；D厂生产的4年陈、5年陈、8年陈、10年陈、13年陈酒以编号D4、D5、D8、D10、D13表示；E厂生产的3年陈、4年陈、5年陈酒以编号E3、E4、E5表示；F厂生产的3年陈、6年陈、9年陈、12年陈酒以编号F3、F6、F9、F12表示）。

Agilent 6820型气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器 美国Agilent公司；TB-215D型微量分析天平 德国赛多利斯股份有限公司；TG-35MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.5μm） 美国Thermo公司；Agilent 10μL气相进样针，Agilent Cerity Chemical色谱工作站。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 进样口温度240℃；升温程序：初始温度40℃保持2min，以5℃/min升至90℃，再以50℃/min升至230℃；检测器温度：300℃；氢气：30mL/min；空气：400mL/min；载气为氮气；流速1mL/min，分流比100∶1，进样量1μL。

1.2.2 样品分析 将枣酒样品按色谱条件进行测定。采用保留时间以及标准添加法定性，外标法定量。以60%乙醇溶液进行参比，计算枣酒样品中甲醇含量时，应乘以60再除以相应的酒精度数值[9]。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

实验中分别将HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）、TG-WAXMS（60m×0.25mm×0.25μm）、TG-35MS（30m×0.25mm×0.5μm）、HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色谱柱进行对比实验。当选用HP-INNOWAX、TG-WAXMS、HP-5MS色谱柱时，甲醇与杂质不能完全分离，而选用TG-35MS时能够把甲醇和杂质很好的分离，并且具有良好的灵敏度，能够满足检测需要。

2.2 色谱条件的优化

实验了不同的柱初始温度与分流比对被测组分分离度的影响。当初始温度为40、50、60、70℃，分流比为：40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1时，进行了色谱条件的组合实验。结果表明：柱的初始温度为40℃，分流比为100∶1时，分离效果比较好，有较高的准确度，保留时间适中（见图1、图2）。因此确定其为最终检测条件。

图1 甲醇标准品气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of methanol standards

图2 枣酒样品气相色谱图Fig.2 GC chromatogram of jujube wine

2.3 回归方程、精密度及检出限的测定

准确称取甲醇标准品4g置于10mL容量瓶中用60%乙醇水溶液定容，得到400mg/mL的储备液。分别吸取储备液用60%乙醇水溶液稀释，配成系列浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、20.00mg/mL的标准溶液。按1.2.1的色谱条件和1.2.2的实验方法进行分析，以组分的浓度（X）对应峰面积（Y）进行线性回归分析，得线性方程、相关系数r、线性范围；准确吸取0.50mg/mL甲醇标准液1μL平行进样6次，统计色谱峰面积，计算相对标准偏差以评价方法的精密度；以3倍信噪比计算检出限，结果见表1。

表1 甲醇的标准曲线、检出限和相对标准偏差Table 1 Standard curve，detection limit and RSD of the methanol

2.4 加标回收率的测定

参照未加标样品中甲醇的含量水平，精确称取30.00mg甲醇标准品加入到10mL枣酒样品中按1.2.1的色谱条件和1.2.2的实验方法进行分析，平行做3份，与未加样品含量比较，计算每份样品的加标回收率，并统计结果（见表2）。

表2 甲醇的平均回收率Table 2 Average recovery of the methanol

从图1、图2可以看到，在选定的分析条件下，甲醇在10min内实现了良好分离。从方法评价的结果来看，此方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度，可以用于枣酒样品中甲醇的分析检测。

2.5 枣酒中甲醇含量分析

分别对五个生产厂家生产的枣酒进行采样和分析。按照上述1.2.1、1.2.2的方法，对21个酒样中甲醇含量进行了分析比较，含量测定结果见图3。

由图3可以看出，由于不同厂家的生产原料品种及生产工艺不同，其生产的枣酒中甲醇含量各不相同。其中B厂生产的枣酒中甲醇含量在3.32～4.08mg/mL之间，以10年陈酒含量最低，4年陈酒含量最高；C厂生产的2年陈、4年陈加酵母酒中甲醇含量分别为3.44mg/mL和4.38mg/mL；D厂生产的所有枣酒中甲醇含量以10年陈酒含量最低为3.57mg/mL，4年陈酒含量最高为4.33mg/mL；E厂生产的三个枣酒中甲醇含量分别为4.74、4.03、3.80mg/mL；F厂生产的枣酒中甲醇含量在3.67～4.29mg/mL之间。以上结果表明，枣酒在陈酿过程中甲醇的相对含量总体呈下降趋势，但变化不大；然而所测枣酒样品甲醇含量均超过国家限制规定（≤1.2mg/mL）[9]。

图3 不同酒龄枣酒中甲醇的含量（n=3）Fig.3 The methanol content of different jujube wine ages（n=3）

3 结论

本项研究对毛细管气相色谱测定甲醇方法进行了优化，本方法具有良好的灵敏度和精密度，且操作简单，可用于枣酒中甲醇含量的质量分析与控制。采用此方法对枣酒中甲醇含量进行测定，结果表明，所测不同酒龄枣酒中甲醇含量在3.32～4.74mg/mL之间。

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