张秀丽，梁单，李红娟，马健飞，胡晔，樊怡，王力宁

（1.中国医科大学第一附属医院肾内科，沈阳，110001；2.本溪市中心医院肾内科，辽宁 本溪，117000；3.中国人民解放军95935部队，哈尔滨，150000）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是慢性肾脏病一体化治疗的主要替代治疗方法。腹膜纤维化是维持性腹膜透析患者常见的严重并发症，是各种原因引起的腹膜问题的最后转归，是导致腹膜结构改变和超滤功能丧失，患者退出腹膜透析的主要原因之一［1］。无论是反复发生的腹膜炎，还是非生物相容性的腹膜透析液或者腹透液在加热处理过程中产生的降解产物，都是引起腹膜纤维化的常见原因［2，3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的裂解成分，是该类细菌的主要致病因素之一。腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）是腹膜发挥透析作用的主要细胞群，在调节腹膜功能，抑制炎症和纤维化中起着关键作用［4］。近年来的研究发现，长期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以导致PMC发生向肌成纤维细胞的转分化，是腹膜组织发生纤维化的早期和可逆阶段。大量的研究表明，必需微量元素锌是机体多种酶的必需组分或激活因子，参与多种信号通路的传导，具有抗炎、抗纤维化、抗氧化应激的作用［5，6］。文献证实，终末期肾脏病患者，包括已经进行血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的锌缺乏［7，8］。以往的研究证实，锌补充能够抑制或减轻一些动物模型和临床患者的纤维化。相反，锌缺乏能够加重或导致纤维化［9］。因此我们有理由推测锌离子可能对PMC的EMT有一定的影响。本实验旨在研究锌离子对LPS诱导的RPMC的EMT的影响，从而为锌离子在PD中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠，体质量120～160 g，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

DMEM/F12干粉培养基和胎牛血清（GIBCO，美国），胰蛋白酶、兔抗大鼠α⁃SMA、脂多糖粉剂（Sig⁃ma，美国），逆转录试剂盒（杭州博日），兔抗大鼠Smad2、Smad3、P⁃Smad2、P⁃Smad3、E⁃cadherin，colla⁃genⅠ抗体（Santa⁃Cruz）。TGF⁃β1 ELISA试剂盒（R﹠D systems，美国）。

1.3 大鼠腹膜间皮细胞的原代培养、传代与鉴定

选择120～160 g雄性清洁级SD大鼠，局麻后无菌取大网膜，在PBS中洗去红细胞，然后用含0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA的PBS液消化（37℃）20～25 min，之后弃去消化液再加入胎牛血清（FBS）终止消化，吹打收集消化下来的单个细胞，4 ℃下离心（800 r/min，5 min），得到细胞团，用DMEM/F12培养液（含青、链霉素100 U/mL及10%FBS）重悬细胞，接种于25 cm2的培养瓶中，在CO2孵箱中培养24 h后首次换液，以后每2～3 d换液1次。待细胞融合达80%时传代，用PBS液洗1次后，加0.125%胰蛋白酶2 mL室温消化3 min，用FBS终止消化，4℃离心，细胞团用DMEM/F12生长液重悬，以2×106/mL的密度接种于25 cm2的培养瓶中，在CO2孵箱中培养24 h后首次换液，以后每2～3 d换液1次。第2代被培养的细胞汇合至90%时经倒置相差显微镜观察并用细胞角蛋白抗体及波形蛋白抗体行免疫组化染色鉴定，明确其为PMC，纯度达到99%以上。第3代细胞用于实验［10］。

1.4 实验分组

第3代腹膜间皮细胞达90%融合时（细胞数约为5×106）进入实验，用1%胎牛血清培养基培养24 h同步化后，随机分为下列各组：（1）正常对照组；（2）脂多糖组：100 μmol/L 作用 48 h；（3）ZnSO4组：30 μmol/L ZnSO4作 用 24 h；（4）ZnSO4/LPS组 ：30 μmol/L ZnSO4作用24 h再加100 μmol/L脂多糖作用48 h。脂多糖及ZnSO4的浓度选择均采用MTT间接法观察在不同时间段和不同剂量下杀伤活性的变化筛选，经多次预实验且参照文献［11］。

1.5 大鼠腹膜间皮细胞增殖率测定

RPMCs接种于96孔培养板，每孔0.1 mL培养基，24 h后细胞贴壁，更换培养液，分别加入100 μmol/L LPS，30 μmol/L ZnSO4，30 μmol/L ZnSO4/100 μmol/L LPS复合培养48 h后每孔加MTT 10 μL，4 h后，吸净培养液，加入 DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶充分溶解，酶标仪测量490 nm波长的吸光度值（OD）。

1.6 免疫荧光

RPMCs转至24孔板，分组处理同前，每组设4个复孔，多聚甲醛固定，0.3%Triton⁃X破膜，BSA室温孵育30 min。一抗4℃孵育过夜，羊抗鼠Alexa Fluor 488标记荧光二抗室温下孵育120 min，DAPI染核3～5 min。荧光显微镜下观察α⁃SMA的表达。α⁃SMA蛋白表达的信号呈红色荧光，DAPI呈蓝色荧光。

1.7 Western印迹法

采用Western印迹法检测α⁃SMA、E⁃cadherin 、collagenⅠ、Smad2、Smad 3、P⁃Smad2、P⁃Smad3蛋白表达。冰上裂解细胞，4℃1 000 r/min离心5 min，留取上清用Bradford法测定蛋白浓度。总蛋白上样于12%SDS⁃PAGE胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST封闭60 min后，分别加入兔抗大鼠α⁃SMA、E⁃cadherin、collagenⅠ和Smad2、Smad 3、P⁃Smad2、P⁃Smad3抗体，小鼠抗大鼠β⁃actin抗体（1∶1 000，北京中杉金桥），4℃过夜，洗膜，分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶1 500，北京中杉金桥）、山羊抗小鼠IgG（1∶1 500，北京中杉金桥），室温孵育2 h，洗膜，ECL发光法显影，扫描仪成像，自动成像系统分析。

1.8 ELISA法检测上清液TNF⁃α和TGF⁃β1的表达

按照TNF⁃α、TGF⁃β1 ELISA试剂盒操作说明测定大鼠腹膜间皮细胞上清液中TNF⁃α、TGF⁃β1的蛋白浓度，450 nm波长测量各孔的光密度值，TNF⁃α、TGF⁃β1含量计算结果以pg/mL表示。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 MTT测定RPMCs增殖

MTT结果显示，LPS明显抑制RPMCs的增殖，而ZnSO4/LPS组的RPMCs的增殖率明显高于LPS组（图1）。

图1 MTT法测定细胞增殖率Fig.1 Assessment of cell viability by MTT assay

2.2 细胞免疫荧光结果

免疫荧光结果显示，LPS培养48 h后细胞形态开始发生变化，由典型的上皮逐渐变为梭形及不规则形，类似肌成纤维细胞，而ZnSO4/LPS组细胞形态改变明显减轻。同时LPS组细胞的α⁃SMA荧光强度明显增加。与此相比，ZnSO4/LPS组的α⁃SMA荧光强度明显下降（图2）。

图2 α⁃SMA荧光显微镜观察×200Fig.2 Expression of α⁃SMA in RPMCs ×200

2.3 锌补充对LPS诱导的RPMCs的α⁃SMA 、E⁃cad⁃herin、collagenⅠ蛋白表达的影响

为了检测锌离子对LPS诱导的RPMCs的EMT的影响，我们采用Western blot方法检测α⁃SMA、E⁃cadherin、collagenⅠ蛋白表达，LPS可导致α⁃SMA 和collagenⅠ的上调表达，锌补充可明显减少LPS导致的α⁃SMA和collagenⅠ的上调表达。同时我们发现，LPS可下调E⁃cadherin的蛋白表达，锌补充可以明显逆转LPS引起的E⁃cadherin蛋白的下调表达（图3）。

图3 锌补充对LPS诱导的RPMCs的EMT标记蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Zn supplementation on the expression of LPS⁃induced EMT proteins

2.4 锌补充对LPS诱导的TNF⁃α和TGF⁃β1产生的影响

与对照组相比，LPS组大鼠腹膜间皮细胞TNF⁃α和TGF⁃β1表达显著升高，与LPS组相比，ZnSO4/LPS组TNF⁃α和TGF⁃β1表达显著降低（图4）。

图4 锌离子对LPS诱导的RPMCs的TNF⁃α和TGF⁃β1表达的影响（ELISA）Fig.4 Effect of Zn ion on the TNF⁃α and TGF⁃β1 expression in the LPS⁃treated RPMCs by ELISA

2.5 锌补充对LPS诱导的TGF⁃β/Smad信号通路的影响

以往的文献证实，TGF⁃β/Smad信号通路在多种细胞发生EMT过程中发挥重要的作用［2］。我们推测锌离子可能通过此通路对LPS诱导的RPMCs的EMT发挥调节作用。我们应用Western blot检测各组TGF⁃β/Smad通路关键蛋白Smad2、Smad3的表达情况。结果显示，LPS组细胞的总Smad2、Smad3表达没有明显改变，而p⁃Smad2、p⁃Smad3表达明显升高，而锌补充能够明显降低LPS引起的P⁃Smad2、p⁃Smad3的上调表达。这表明TGF⁃β/Smad信号通路在锌离子介导的RPMCs的阻抑EMT过程中起到重要作用（图5）。

图5 锌离子对LPS诱导的Smad2，Smad 3，P⁃Smad2，P⁃Smad 3蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Zn supplementation on the expression of Smad2，Smad 3，P⁃Smad2 and P⁃Smad 3 in the LPS⁃treated RPMCs

3 讨论

腹膜透析是利用腹膜作为半透膜通过弥散和渗透原理清除机体内代谢废物和多余的水分，是终末期肾脏病替代治疗的主要手段之一。一直认为，腹膜组织固有的成纤维细胞的激活和浸润的炎性细胞是引起腹膜结构和功能改变的最主要因素［12］。然而，近年来的研究发现，长期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以导致腹膜间皮细胞发生向间充质细胞的转分化（EMT）［12］。EMT是一个高度调控的过程，在胚胎发育、肿瘤发生发展以及一些慢性炎症疾病纤维化过程中发挥重要作用。腹膜间皮细胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐渐降低的关键因素之一。以往的研究证实，锌补充能够抑制或减轻一些动物模型的纤维化和临床上的慢性炎症疾病，例如肝纤维化、心肌纤维化、血管纤维化以及系统性纤维化等［9］。相反，锌缺乏能够加重或导致纤维化。文献证实，终末期肾脏病患者，其中包括血液透析和腹膜透析［7，8］的患者均存在不同程度的锌缺乏。因此我们有理由推测锌离子可能对腹膜透析相关的腹膜的纤维化有一定的影响。本实验中，LPS可以诱导体外培养的RPMCs发生EMT，而锌补充可以有效抑制EMT。此外，锌补充明显抑制了TGF⁃β/Smad信号通路，其可能是锌离子产生抗EMT作用的机制之一。

以往研究表明，多种原因可导致PMCs发生EMT。例如，以高糖为主的腹透液、TGF⁃β1、氧化应激产物等［13］。RPMCs间存在着多种连接，其中黏合连接的主要结构成分E⁃cadherin以膜外段与相邻的细胞表面同型分子聚合，胞内段与膜内连环蛋白（β⁃catenin）结合，而连环蛋白与肌动蛋白结合锚定微丝束末端于膜内面，三者所组成的骨架系统对维持RPMCs层的完整性至关重要［1］。胶原是细胞外基质的主要成分，其中胶原Ⅰ具有代表性，其占成纤维细胞和其他细胞合成胶原总量的80%。所以我们选用了collagenⅠ作为观察的指标，并检测其蛋白水平的变化。本研究通过免疫荧光检查显示，在LPS干预下，RPMCs中成纤维样细胞表型标志物α⁃SMA表达明显增加，同时细胞形态由典型的上皮形态逐渐变为梭形及不规则形，类似肌成纤维细胞。证实了LPS具有诱导RPMCs发生EMT的作用。加入Zn⁃SO4后发现，与LPS组相比，α⁃SMA荧光强度明显减弱，同时细胞形态改变也明显减轻，提示ZnSO4具有一定抑制RPMCs的EMT的作用。为了进一步证实ZnSO4的这种作用，我们采用Western blot方法对EMT标记性蛋白进行检测，结果发现在LPS干预下，RPMCs的α⁃SMA 、collagenⅠ蛋白表达显著上调，E⁃cadherin蛋白表达显著下调；而应用ZnSO4后RPMCs上述改变显著得到抑制，进一步表明ZnSO4可以抑制LPS诱导的RPMCs发生EMT，从而可能抑制LPS诱导的腹膜纤维化的进程。

锌离子具有抑制多种细胞因子产生，从而在抗凋亡、抗炎及抗纤维化过程中发挥重要作用［14］。以往的研究证实锌离子可以降低由乙醇诱导的体外培养的肝细胞TGF⁃β1的高表达及TGF⁃β/Smad 信号转导通路的激活进而抑制肝细胞纤维化的发生［15］。TGF⁃β1是EMT的关键调节因子，主要通过Smad信号蛋白来实现信号的胞内传递。已有许多文献报道认为Smad信号蛋白在各器官的纤维化中发挥着重要的作用，如肾、肝、肺、心、皮肤等。最近研究发现TGF⁃β1不仅可诱导体外HPMCs发生EMT而且也可诱导体内HPMCs发生EMT。TGF⁃β1主要通过 smad 途径介导 EMT［12］。TGF⁃β1 通过与TGF⁃β I型受体结合进一步激活下游信号通路。其在EMT中主要的目的基因调节依赖于smad2、smad3的转 录 调节。在本研究中，LPS可使 TGF⁃β1、P⁃smad2、P⁃smad3 表达显著上调，而加入ZnSO4后，TGF⁃β1，以及P⁃smad2、P⁃smad3蛋白表达显著下调，提示ZnSO4具有抑制TGF⁃β/Smad信号转导通路的作用，从而可能抑制EMT的发生和发展。

本研究结果显示，LPS可诱导RPMCs发生EMT，并促进RPMCs致纤维化相关细胞因子高表达。ZnSO4能在一定程度上抑制LPS诱导的RPMCs的EMT，这一作用可能是通过调节TGF⁃β/Smad信号转导通路实现的。本研究将为明确锌离子在腹膜透析相关性腹膜纤维化中的作用和相关机制，寻找有效干预腹膜纤维化的关键环节与分子靶点提供新的科学依据。

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